【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物传感器及其在检测转基因植物中的应用，尤其涉及sers生物传感器及其制备方法和在检测转基因玉米瑞丰125中的应用，属于生物传感器及其在检测转基因玉米应用的领域。
技术介绍
1、虫害是造成玉米减产的一大重要因素，随着全球气候变暖，玉米螺的危害进一步加重。近年来，为了防治玉米虫害人们通常使用各类杀虫剂。但大量杀虫剂在使用过程中会带来环境污染问题或者效果不稳定的情况。转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125是导入转抗虫基因crylab/cry2aj和除草剂耐受基因g10evo-epsps后获得的转基因株系(陈欲,陈笑芸,彭城,等.转基因玉米双抗12-5荧光rpa现场可视化检测方法的建立[j].遗传,2021,43(8):802-812.)。该基因表达蛋白能够有效地控制玉米田间害虫玉米蟆、棉铃虫及黏虫等鳞翅目害虫的发生，从而大幅度地降低杀虫剂的使用量，减少生产成本以及农药对环境和农作物产品的污染。另外，在农业农村部科技教育司公布的2021年农业转基因生物安全证书(生产应用)批准清单中也有该品种。但转基因作物所涉及到的食品安全和环境安全问题一直受到消费者、政府和相关机构的关注。许多国家和地区制定了转基因生物安全管理条例，实施了标签制度，积极发展转基因食品检测和监测技术。因此，对转基因玉米瑞丰125进行分析检测具有重要意义。
2、目前，转基因生物的检测主要采用传统的检测方法，如聚合酶链式反应、电化学法、荧光法和许多其他方法。然而，这些方法受到样品前处理复杂、反应条件苛刻和检测灵敏度低的限制。为了克服这些缺点，开发一种高效
3、表面增强拉曼散射(sers)是一种强大的光谱技术，它结合了拉曼光谱和纳米光学的技术优势。与其他技术相比，表面增强拉曼光谱技术具有灵敏度高、快速检测、水分干扰小、分子指纹图谱和痕量检测等特点。因此，近年来，表面增强拉曼光谱在食品安全、生物传感器、环境监测、医疗诊断等领域得到了广泛的应用。金属纳米粒子(如金和银纳米粒子)的等离子体性质可以通过控制它们的尺寸、形状、表面形貌和二维阵列中的组装结构来调节，这些粒子在各种应用中得到了广泛的探索。在表面增强拉曼散射中，粒子之间纳米缝隙结处的等离子体耦合效应引起了巨大的电磁增强，使得sers信号能够以单分子灵敏探测到。
4、在过去的几年中，sers因其高度的灵敏度而成为检测食品中转基因生物的一种强有力的技术。然而，由于转基因植物庞大的基因组序列以及三维螺旋的结构对于进一步提高检测灵敏度来说是非常有限的。
5、簇状规则间隔短回文重复序列(crispr)是一种新的基因编辑工具，其中crispr/cas9系统因其简单和高效而被最广泛地应用于基因编辑中。但其在核酸检测方面还没有得到充分的利用。crispr/cas9系统在其引导rna以及pam位点的双重作用下可以特异性的切割dna双链(zuo z,liu j.structure and dynamics of cas9 hnh domain catalyticstate[j].science reports,2017,7(1):17271.hajian r,balderston s,tran t,etal.detection of unamplified target genes via crispr-cas9immobilized on agraphene field-effect transistor[j].nature biomedical engineering,2019,3(6):427-437.)。这一功能使其在dna检测方面具有巨大的潜力，可以作为一种信号放大方法，以追求对低或超低含量的超灵敏检测。crispr-cas9作为基于crispr的工具具有高度的特异性，即使在单核苷酸多态性水平上也有利于同源和同源细菌和病毒的分型检测。crispr/cas9具有设计简单、操作方便、成本低的特点；因此，如果将crispr/cas9和sers生物传感器相结合有可能显著提高转基因玉米瑞丰125的检测灵敏度。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是提供用于检测转基因玉米瑞丰125的sers生物传感器；
2、本专利技术的目的之二将所述的sers生物传感器应用于检测转基因玉米瑞丰125。
3、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
4、本专利技术首先提供了检测转基因玉米瑞丰125的sers生物传感器，包括：用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的cas9-tracrrna-crrna系统、信号单元(aurnnps-pdna)以及捕获单元(fe3o4-cdna)。
5、本专利技术的用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的cas9-tracrrna-crrna系统包括：crrna1、crrna2、tracrrna以及cas9酶；所述crrna1的核苷酸序列为seq id no.1所示，其中，在seq id no.1所示的核苷酸的5'和3'端均连接有生物素；所述crrna2的核苷酸序列为seq id no.2所示，其中，在seq id no.2所示的核苷酸的5'和3'端均连接有生物素；所述tracrrna的核苷酸序列为seq id no.3所示，其中，在seq id no.3所示的核苷酸的5'和3'端均连接有生物素；所述转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的核苷酸序列为seq id no.6所示。
6、本专利技术中所述的信号单元的制备方法包括：将拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4-mba)分布在金纳米粒子之中形成具有特征sers光谱的拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子(aurnnps)，将探针dna(pdna)以au-s键固定在拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子的表面，得到信号单元；其中，所述的探针dna(pdna)的核苷酸序列为seq id no.5所示；优选的，在探针dna的5'端连接有sh2-(ch2)6-。
7、作为本专利技术一种优选的具体实施方案，所述的拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子的制备方法包括：(1)将4-巯基苯甲酸溶液、ctac溶液、aa溶液和haucl4溶液混合得到混合液；(2)将aunps溶液注入上述混合液中，震荡；再加入haucl4溶液继续震荡后得到拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子(aurnnps)。
8、作为一种优选的具体实施方案，所述的4-巯基苯甲酸溶液是浓度为50μm 4-巯基苯甲酸溶液；所述的ctac溶液是浓度为40mm ctac溶液；所述的aa溶液是浓度为0.1m aa溶液。
9、作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的haucl4溶液是浓度为1mm haucl4溶液；步骤(2)中所述的haucl4溶液是浓度为10mm haucl4溶液。
10、作为一种优选的具体实施方案，所述aunps的制备方法包括：将aa溶液与ctac溶液混合后加入10nm金球溶液；在搅拌下加入haucl4溶液得到混合物；向混合物中加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SERS生物传感器，其特征在于，包括：用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tDNA的Cas9-tracrRNA-crRNA系统、信号单元以及捕获单元。
2.根据权利要求1所述的SERS生物传感器，其特征在于，所述的用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tDNA的Cas9-tracrRNA-crRNA系统包括：crRNA1、crRNA2、tracrRNA以及Cas9酶；所述crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述tracrRNA的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述转基因玉米瑞丰125的特征基因的tDNA的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求1所述的SERS生物传感器，其特征在于，所述的信号单元的制备方法包括：将拉曼信号分子4-巯基苯甲酸分布在金纳米粒子之中形成具有特征SERS光谱的拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子，再将探针DNA以Au-S键固定在拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子的表面得到信号单元；
4.根据权利要求3所
5.根据权利要求4所述的SERS生物传感器，其特征在于，所述AuNPs溶液的制备方法包括：将抗坏血酸溶液与十六烷基三甲基氯化铵溶液混合后加入10nm金球溶液；在搅拌下加入HAuCl4溶液得到混合物；向混合物中加入有效氯为6-14％的NaClO溶液搅拌；最后再加入HAuCl4溶液静置即得AuNPs溶液；优选的，所述10nm金球的制备方法包括：将抗坏血酸溶液与十六烷基三甲基氯化铵溶液混合后再向混合溶液中加入AuNPs种子溶液，在搅拌下加入HAuCl4溶液即得到10nm金球；其中，所述AuNPs种子溶液的制备方法包括：将HAuCl4溶液与十六烷基三甲基氯化铵溶液混合后再加入NaBH4溶液，搅拌，当混合溶液颜色由浅黄色变为棕黄色，得到AuNPs种子溶液。
6.根据权利要求1所述的SERS生物传感器，其特征在于，所述的捕获单元的制备方法包括：将被戊二醛活化的氨基化四氧化三铁纳米颗粒与cDNA混合振荡得到混合物；将混合物加入缓冲溶液中静置除去游离的cDNA后重新于缓冲液中，即得捕获单元。
7.根据权利要求6所述的SERS生物传感器，其特征在于，所述的被戊二醛活化的氨基化四氧化三铁纳米颗粒的制备方法包括：将Fe3O4-NH2纳米颗粒添加到2.5wt％戊二醛水溶液中搅拌，即得；
8.权利要求1-7任何一项所述的SERS生物传感器在检测转基因玉米瑞丰125中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)或步骤(3)中所述的孵育在温度25℃-45℃的温度下进行孵育，优选为在37℃温度下进行孵育；所述的孵育时间为45min；
...【技术特征摘要】
1.一种sers生物传感器，其特征在于，包括：用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的cas9-tracrrna-crrna系统、信号单元以及捕获单元。
2.根据权利要求1所述的sers生物传感器，其特征在于，所述的用于特异性切割转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的cas9-tracrrna-crrna系统包括：crrna1、crrna2、tracrrna以及cas9酶；所述crrna1的核苷酸序列为seq id no.1所示；所述crrna2的核苷酸序列为seq id no.2所示；所述tracrrna的核苷酸序列为seq id no.3所示；所述转基因玉米瑞丰125的特征基因的tdna的核苷酸序列为seq id no.6所示。
3.根据权利要求1所述的sers生物传感器，其特征在于，所述的信号单元的制备方法包括：将拉曼信号分子4-巯基苯甲酸分布在金纳米粒子之中形成具有特征sers光谱的拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子，再将探针dna以au-s键固定在拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子的表面得到信号单元；
4.根据权利要求3所述的sers生物传感器，其特征在于，所述的拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子的制备方法包括：(1)将4-巯基苯甲酸溶液、十六烷基三甲基氯化铵溶液、抗坏血酸溶液和haucl4溶液混合得到混合液；(2)将aunps溶液注入上述混合液中，震荡；再加入haucl4溶液继续震荡后得到拉曼增强的金纳米桥纳米间隙粒子；
5.根据权利要求4所述的sers生物传感器，其特征在于，所述aunps溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪小福，徐俊锋，彭城，陈笑芸，徐晓丽，魏巍，杨蕾，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。