【技术实现步骤摘要】
本公开涉及到基因工程和生物催化领域，具体地涉及与塔格糖生产有关的生物。更具体地说，本公开涉及一种包含新型的塔格糖6-磷酸差向异构酶和/或塔格糖6-磷酸磷酸酶的组合物以及使用其制备塔格糖的方法。
技术介绍
1、d-塔格糖(d-tagatose，以下简称塔格糖)是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。其甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性，在2001年被美国食品药品监督管理局(us fda)正式批准为普遍公认安全食品(gras)，2005年被欧盟批准在欧洲上市。塔格糖具有四大功能：低能量，降血糖，改善肠道菌群和抗龋齿(oh d-k:tagatose:properties,applications,and biotechnological processes.app.microbiol.biotechnol.2007,76:1-8)。因此，目前塔格糖已被广泛用于食品、饮料、护齿产品等领域。
2、目前塔格糖工业制备方法主要包括使用半乳糖作为主要原料的化学方法(碱性催化反应)和生物方法(异构化酶反应)(cn 201080067326.6和cn 201810018301.5)。然而，在目前的制备方法中，作为半乳糖的基础原料的乳糖价格不稳定，其取决于全球市场上生乳和乳糖的产量、供应量和需求量等，这使得塔格糖生产原料的稳定供应受到
3、中国专利文献cn 201610937656.5公开了以价格低廉的淀粉、纤维素或它们的衍生物或者以蔗糖为底物，通过体外多酶分子机器将底物高效转化为塔格糖的方法。该方法涉及以淀粉、纤维素或它们的衍生物或者以蔗糖为底物依次制备葡萄糖1-磷酸(g1p)、葡萄糖6-磷酸(g6p)和果糖6-磷酸(f6p)，然后利用塔格糖6-磷酸差向异构酶(tpe)将果糖6-磷酸转化为塔格糖6-磷酸(t6p)，并通过最后一步不可逆的反应利用塔格糖6-磷酸磷酸酶(t6pp)催化塔格糖6-磷酸制备塔格糖。该方法可以显著提高塔格糖的转化率，生产成本低，有利于大规模生产。然而，这种体外多酶分子机器生产塔格糖的方法具有显著的改进，但是仍然希望和需要提供生产塔格糖的进一步改进的方法，例如，使用比之前途径中所使用的更有效的酶或者酶的组合，以降低酶的使用量或者提高塔格糖的产率，从而进一步降低塔格糖的生产成本，促进塔格糖的商业转化。
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、专利技术人对利用体外多酶分子机器生产塔格糖的方法进行了深入的研究，发现了未经报道的一些新酶具有果糖6-磷酸转化为塔格糖6-磷酸的活性，其中部分新酶具有更优异的果糖6-磷酸转化为塔格糖6-磷酸的活性；发现另一些酶具有塔格糖6-磷酸去磷酸化生成塔格糖的活性，其中部分新酶具有更优异的塔格糖6-磷酸去磷酸化生成塔格糖的活性，并发现这些酶在用于塔格糖生产时得到较好的结果，从而完成本公开。
3、用于解决问题的方案
4、本公开提供了如下技术方案。
5、(1)选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸差向异构酶的用途，其中，所述多肽：
6、(i)具有如seq id no：1-4任一项所示序列的多肽；
7、(ii)与(i)所示序列具有至少70％的序列同一性，且不包括seq id no：1-4任一项所示序列的多肽；
8、(iii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
9、(a)编码如(i)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
10、(b)(a)的全长互补多核苷酸；
11、(iv)由(i)、(ii)、(iii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有塔格糖6-磷酸差向异构酶活性。
12、(2)根据(1)所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自rhodothermus，anaerolinea，ignisphaera或thermoflexia；更优选的，所述耐热微生物选自rhodothermus marinus，anaerolinea thermolimosa，ignisphaera aggregans或thermoflexia bacterium。
13、(3)选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸磷酸酶的用途，其中，所述多肽：
14、(v)具有如seq id no：5-7任一项所示序列的多肽；
15、(vi)与(v)所示序列具有至少70％的序列同一性，且不包括seq id no：5-7任一项所示序列的多肽；
16、(vii)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在非常高严格条件下与(a)或(b)所示的多核苷酸杂交：
17、(a)编码如(v)所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
18、(b)(a)的全长互补多核苷酸；
19、(viii)由(v)、(vi)、(vii)所示的多肽的片段，并且所述片段仍然具有塔格糖6-磷酸磷酸酶活性。
20、(4)根据(3)所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自thermomonospora，spirochaeta或hungateiclostridium；更优选的，所述耐热微生物选自thermomonospora curvata，spirochaeta thermophila或hungateiclostridium thermocellum。
21、(5)用于生产塔格糖的酶组合物，其中，所述酶组合物包含塔格糖6-磷酸差向异构酶和/或塔格糖6-磷酸磷酸酶。
22、(6)根据(5)所述的酶组合物，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶为(1)-(2)任一项所述用途中的所述多肽，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶为(3)-(4)任一项所述用途中的所述多肽。
23、(7)根据(5)-(6)任一项所述的酶组合物，其中，所述酶组合物还含有如下酶组成的组中的一种或多种：淀粉分支酶(包括异淀粉酶和普鲁兰酶)、α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、麦芽糖磷酸化酶、β-葡萄糖磷酸变位酶、多聚磷酸葡萄糖激酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、4-葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶。...
【技术保护点】
1.选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸差向异构酶的用途，其中，所述多肽：
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自Rhodothermus，Anaerolinea，Ignisphaera或Thermoflexia；更优选的，所述耐热微生物选自Rhodothermus marinus，Anaerolineathermolimosa，Ignisphaera aggregans或Thermoflexia bacterium。
3.选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸磷酸酶的用途，其中，所述多肽：
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自Thermomonospora，Spirochaeta或Hungateiclostridium；更优选的，所述耐热微生物选自Thermomonospora curvata，Spirochaeta thermophila或Hu
5.用于生产塔格糖的酶组合物，其中，所述酶组合物包含塔格糖6-磷酸差向异构酶和/或塔格糖6-磷酸磷酸酶。
6.根据权利要求5所述的酶组合物，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶为权利要求1-2任一项所述用途中的所述多肽，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶为权利要求3-4任一项所述用途中的所述多肽。
7.根据权利要求5-6任一项所述的酶组合物，其中，所述酶组合物还含有如下酶组成的组中的一种或多种：淀粉分支酶(包括异淀粉酶和普鲁兰酶)、α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、麦芽糖磷酸化酶、β-葡萄糖磷酸变位酶、多聚磷酸葡萄糖激酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、4-葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶。
8.表达权利要求5-7任一项所述酶组合物的菌株或菌株组合物。
9.根据权利要求8所述的菌株或菌株组合物，其特征在于，所述菌株或菌株组合物的宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选的，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
10.根据权利要求8-9任一项所述的菌株或菌株组合物，其中，所述菌株或菌株组合物中转化如下表达载体：
11.根据权利要求10所述的菌株或菌株组合物，其中，所述菌株或菌株组合物中还转化含有编码淀粉分支酶(包括异淀粉酶和普鲁兰酶)、α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、麦芽糖磷酸化酶、β-葡萄糖磷酸变位酶、多聚磷酸葡萄糖激酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、4-葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、或β-淀粉酶的核酸的表达载体。
12.权利要求5-7任一项所述的酶组合物或者权利要求8-11任一项所述的菌株或菌株组合物在生产塔格糖中的应用。
13.塔格糖的生产方法，其中，所述方法包括：添加权利要求5-7任一项所述的酶组合物或接种权利要求8-11任一项所述的菌株或菌株组合物，将底物转化为塔格糖的步骤；
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法包括在所述反应中进一步添加金属离子或金属盐的步骤；优选的，所述金属选自能够形成二价阳离子的金属；更优选的，所述金属选自由镁、镍、锰、锌、钴、铁、铜、钙、钼、硒组成的组中的一种或多种。
15.根据权利要求13-14任一项所述的方法，其中，所述底物选自糖类或其衍生物；优选的，所述发酵底物选自包含如下组份组成的组中的一种或多种：淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖。
16.根据权利要求13-15任一项所述的方法，其中，所述方法选自包含如下组份组成的组中的一种或多种：多酶催化、全细胞催化、含有酶/全细胞的发酵物催化、固定化多酶催化、固定化全细胞催化。
...【技术特征摘要】
1.选自如下(i)-(iv)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸差向异构酶的用途，其中，所述多肽：
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自rhodothermus，anaerolinea，ignisphaera或thermoflexia；更优选的，所述耐热微生物选自rhodothermus marinus，anaerolineathermolimosa，ignisphaera aggregans或thermoflexia bacterium。
3.选自如下(v)-(viii)组成的组中的任一项的多肽作为塔格糖6-磷酸磷酸酶的用途，其中，所述多肽：
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶来源于耐热微生物；优选的，所述耐热微生物选自thermomonospora，spirochaeta或hungateiclostridium；更优选的，所述耐热微生物选自thermomonospora curvata，spirochaeta thermophila或hungateiclostridium thermocellum。
5.用于生产塔格糖的酶组合物，其中，所述酶组合物包含塔格糖6-磷酸差向异构酶和/或塔格糖6-磷酸磷酸酶。
6.根据权利要求5所述的酶组合物，其中，所述塔格糖6-磷酸差向异构酶为权利要求1-2任一项所述用途中的所述多肽，所述塔格糖6-磷酸磷酸酶为权利要求3-4任一项所述用途中的所述多肽。
7.根据权利要求5-6任一项所述的酶组合物，其中，所述酶组合物还含有如下酶组成的组中的一种或多种：淀粉分支酶(包括异淀粉酶和普鲁兰酶)、α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖磷酸异构酶、麦芽糖磷酸化酶、β-葡萄糖磷酸变位酶、多聚磷酸葡萄糖激酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、4-葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：马延和，石婷，李运杰，
申请(专利权)人：天津怡和生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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