【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程，涉及一种花生早期vigs沉默体系及其构建方法。
技术介绍
1、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mrna降解或被甲基化等修饰，从而引起植物内源基因沉默、引起表型或生理指标变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。vigs是根据植物对rna病毒防御机制发展起来的一种用以表征植物基因功能的基因转录技术，其内在的分子基础可能是转录后基因沉默(post-transcriptgene silence)。与传统的基因功能分析方法相比，vigs能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析，而无需开发稳定的转化子，并且具有沉默单个或多个基因家族成员的潜力。
2、花生是世界上重要的油料作物作物之一，同时也是日常生活深受人们喜爱的食物之一。我国是世界上最大的花生消费国，2019/2020年度国内花生消费总量达到约1700万t。2019年我国花生播种面达到465万hm2，约占世界花生种植面积的17.8％，我国花生产量占全国油料总产量的一半左右，占世界花生总产量的39.2％，一直稳居全球第一位。目前，我国花生育种水平和种植技术处于世界先进水平，花生单产一直位于世界第一位。2019年我国花生单产达到3.768t/hm2，是世界平均水平的2.23倍。花生属于双子叶植物，是农杆菌的天然宿主之一，且为自花授粉，虽然近年来花生的遗传转化取得了一定进展，但目前所构建的花生遗传转化体系存在
3、ahmule基因(genbank accession on513415)，从花生品种中花2号克隆获得。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种花生早期vigs沉默体系及其构建方法，为花生功能基因组学研究提供技术支撑。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、花生早期vigs沉默体系，包括目的基因特异性片段和含有目的基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体质粒；ptrv2病毒沉默表达载体质粒由目的基因特异性片段连接至ptrv2载体中构建获得。
4、目的基因为ahmule，目的基因特异性片段为序列表seq.id.no.1的碱基序列。
5、上述花生早期vigs沉默体系的构建方法，主要包括以下步骤：
6、(一)载体的构建
7、(二)农杆菌转化及侵染液的准备
8、(三)侵染花生种子。
9、步骤(一)按以下进行：
10、(1)从花生cdna中扩增出目的基因a的特异性片段；
11、(2)提取ptrv2质粒，选择bamhi和ecori酶切位点，设计特异性引物并增加合适长度的同源臂序列，双酶切载体质粒；
12、(3)运用同源重组的方法连接目的基因的特异性片段及线性化的ptrv2载体；
13、(4)转化大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌落进行菌液pcr鉴定阳性。
14、步骤(二)按以下进行：
15、(1)通过冻融法将构建完成的ptrv2-ahmule和重组质粒转化进农杆菌gv3101感受态细胞；
16、(2)接种到50ml yep液体培养基，200rpm，28℃培养至od600为0.8；yep液体培养基含有25mg/l利福平(rif)、25mg/l链霉素(str)、100mg/l卡那霉素(kana)；
17、(3)水平离心机4800rpm离心30m，收集菌体，30ml无抗生素lb重悬菌体，离心，弃上清；
18、(4)50ml lb液体培养基重悬菌体；lb液体培养基含10mm/l mes，10mm/l氯化镁，200μm/l as；
19、(5)ptrv2、ptrv2-ahmule、ptrv2-ahpds的菌液分别和ptrv1菌液等量混合，室温孵育3h，用于下一步浸染种子。
20、步骤(三)按以下进行：将现剥的花生种子置于超净台中，先用75％的酒精浸洗30s，用0.1％的升汞灭菌5-8min，用无菌水洗涤4-5次，去除种皮，并在子叶背面划口子；将种子浸入od600为0.8的菌液中，浸染120min，取出种子，放在ms培养基上26℃暗培养2-3d，发芽后取出水培观察表型。
21、上述花生早期vigs沉默体系的构建方法，还包括步骤(四)花生材料的培养，该步骤按以下进行：将上述花生材料转移至hoagland培养液中水培，每间隔两天更换一次培养液，培养条件为26±2℃、光照30–50μmol m-2s-1、光照周期16/8h，观察植株叶片表型变化。
22、上述花生早期vigs沉默体系的构建方法，还包括步骤(五)沉默花生的早期检测，该步骤按以下进行：大概1周，花生长出第一片真叶后，阳性对照出现黄叶现象，此时对花生叶片检测ahmule基因的表达情况，即构建得到目的基因沉默的早期花生植株。
23、目的基因a为ahmule。
24、上述花生早期vigs沉默体系、花生早期vigs沉默体系的构建方法在沉默花生目的基因中的应用。
25、在前期研究的基础上，专利技术人构建了一种花生早期vigs沉默体系及相关方法，该沉默体系包括目的基因特异性片段和含有目的基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体质粒；ptrv2病毒沉默表达载体质粒由目的基因特异性片段连接至ptrv2载体中构建获得。相应构建方法主要是通过构建含有目的基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体质粒，农杆菌介导法转化花生，诱导花生目的基因在花生生长的早期阶段发生沉默。本专利技术建立了早期ptrv-vigs沉默花生内源基因从而鉴定基因功能的体系，应用于目的基因ahmule，结果表明，大概1周，阳性对照出现黄叶现象，此时对实验组的花生叶片检测ahmule基因的表达情况，即构建得到目的基因沉默的早期花生植株，该法有效降低了花生目的基因ahmule的表达水平。因此，本专利技术是一种高效、快速的遗传转化方法，方法更为简单，沉默效率更高，易于操作，为研究花生基因功能实现了重要技术突破，提供了新途径。
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1.一种花生早期VIGS沉默体系，其特征在于包括目的基因特异性片段和含有目的基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒；所述pTRV2病毒沉默表达载体质粒由目的基因特异性片段连接至pTRV2载体中构建获得。
2.根据权利要求1所述的花生早期VIGS沉默体系，其特征在于：所述目的基因为AhMULE，所述目的基因特异性片段为序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
3.权利要求1所述花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(一)按以下进行：
5.根据权利要求3所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(二)按以下进行：
6.根据权利要求3所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(三)按以下进行：将现剥的花生种子置于超净台中，先用75％的酒精浸洗30s，用0.1％的升汞灭菌5-8min，用无菌水洗涤4-5次，去除种皮，并在子叶背面划口子；将种子浸入OD600为0.8的侵染液中，浸染120min，
7.根据权利要求6所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于还包括步骤(四)花生材料的培养，该步骤按以下进行：将上述花生材料转移至Hoagland培养液中水培，每间隔两天更换一次培养液，培养条件为26±2℃、光照30–50μmol m-2s-1、光照周期16/8h，观察植株叶片表型变化。
8.根据权利要求3所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于还包括步骤(五)沉默花生的早期检测，该步骤按以下进行：大概1周，花生长出第一片真叶后，阳性对照出现黄叶现象，此时对花生叶片检测AhMULE基因的表达情况，即构建得到目的基因沉默的早期花生植株。
9.权利要求1所述的花生早期VIGS沉默体系、权利要求4和5所述的花生早期VIGS沉默体系的构建方法在沉默花生目的基因中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种花生早期vigs沉默体系，其特征在于包括目的基因特异性片段和含有目的基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体质粒；所述ptrv2病毒沉默表达载体质粒由目的基因特异性片段连接至ptrv2载体中构建获得。
2.根据权利要求1所述的花生早期vigs沉默体系，其特征在于：所述目的基因为ahmule，所述目的基因特异性片段为序列表seq.id.no.1的碱基序列。
3.权利要求1所述花生早期vigs沉默体系的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的花生早期vigs沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(一)按以下进行：
5.根据权利要求3所述的花生早期vigs沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(二)按以下进行：
6.根据权利要求3所述的花生早期vigs沉默体系的构建方法，其特征在于步骤(三)按以下进行：将现剥的花生种子置于超净台中，先用75％的酒精浸洗30s，用0.1％的升汞灭菌5-8min，用无菌水洗涤4...
【专利技术属性】
技术研发人员：詹洁，罗淑贞，何龙飞，王爱勤，肖冬，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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