【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用全细胞转化高效生产α-酮异戊酸的方法，属于分子生物技术与酶工程。
技术介绍
1、α-酮异戊酸在食品、日化和医药等方面显示出了日益广阔的应用前景。在食品应用上，可作为运动营养饮料的成分；在功能型护肤化妆品中，能起到很好的保湿、防皱、防缩、抗老化和抗过敏作用。在医疗应用上，复方α-酮酸片(含酮异戊酸钙盐)可治疗因慢性肾功能不全而造成的损害，并可作为治疗尿毒症的特效药。α-酮异戊酸的合成主要有以下几种方法：采用格式试剂与草酸二乙酯反应，该方法摩尔收率较高，但反应条件苛刻，需无水、高纯度氮(氩)气氛和低温条件，特别是较低的温度，在工业条件下较难控制；采用海因与丙酮反应生成亚异丙基海因，亚异丙基海因再经过水解得到产品，该路线采用海因、丙酮，氯化钙等为原料，原料简单比较适合工业化，但应该考虑水解时分解产生的大量氨气和碳酸根造成的环境污染；采用腈醇为原料，经过反应转化为α-羟基-n-叔丁基酰胺，再氧化成酮胺，接着水解，得到目标产物，该方法原料昂贵、毒性大、污染严重、反应步骤多、成本高，因此不适合工业化生产。综上所述，目前公开制备α-酮异戊酸的方法中，存在产品杂质过多，不易精制，后处理步骤繁琐，成本高等问题，不适合工业上大规模生产。
技术实现思路
1、针对化学制备α-酮异戊酸的方法中，存在产品杂质过多，不易精制，后处理步骤繁琐，成本高等问题，不适合工业上大规模生产。本专利技术公开了一种利用全细胞转化高效生产α-酮异戊酸的方法，并利用l-氨基酸脱氨酶改造一定程度上提高了α-酮异
2、本专利技术通过在大肠杆菌细胞中异源表达合成α-酮异戊酸的关键酶并进行改造。最后，通过全细胞催化体系的优化，实现了酮异戊酸的高效生产。本研究为开发大规模生产酮异戊酸及相关化合物的生物转化系统提供了借鉴。
3、本专利技术提供了一种l-氨基酸脱氨酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq idno.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a，核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为t79a，核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s80a，核苷酸序列如seq id no.4所示。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为l315a，核苷酸序列如seq id no.5所示。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第79位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/t79a，核苷酸序列如seq id no.6所示。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/s80a。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/l315a。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为t79a/s80a。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为t79a/l315a。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s80a/l315a。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqidno.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第80位的丝氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/t79a/s80a，核苷酸序列如seq id no.7所示。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/t79a/l315a。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/s80a/l315a。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为t79a/s80a/l315a。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seqid no.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位的丝氨酸突变为丙氨酸，第79位的苏氨酸突变为丙氨酸，第80位的丝氨酸突变为丙氨酸，同时将第315位的亮氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为s72a/t79a/s80a/l315a，核苷酸序列如seq id no.8所示。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-氨基酸脱氨酶来源于：proteusmyxofaciens；编码所述亲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
2.根据权利要求1所述的L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述L-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的L-氨基酸氧化酶进行突变后得到的突变体：S72A、T79A、S80A、L315A、S72A/T79A、S72A/S80A、S72A/L315A、T79A/S80A、T79A/L315A、S80A/L315A、S72A/T79A/S80A、S72A/T79A/L315A、S72A/S80A/L315A、T79A/S80A/L315A或S72A/T79A/S80A/L315A。
3.编码权利要求1或2所述的L-氨基酸脱氨酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达了权利要求1或2所述的突变体，或携带了权利要求3所述的基因，或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。
6.根据权利要求5所
7.一种提高L-氨基酸脱氨酶酶活的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的L-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变，具体为：S72A、T79A、S80A、L315A、S72A/T79A、S72A/S80A、S72A/L315A、T79A/S80A、T79A/L315A、S80A/L315A、S72A/T79A/S80A、S72A/T79A/L315A、S72A/S80A/L315A、T79A/S80A/L315A或S72A/T79A/S80A/L315A。
8.一种制备α-酮异戊酸的方法，其特征在于，所述方法为，以权利要求1或2所述的L-氨基酸脱氨酶突变体，或以权利要求5或6所述的重组细胞为催化剂，催化L-缬氨酸制备得到α-酮异戊酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述L-氨基酸脱氨酶突变体或重组细胞添加至含有90～110g/L L-缬氨酸的转化体系中，转化体系的溶剂为自来水，在通气量为1.5～3vvm的条件下反应制备得到α-酮异戊酸。
10.权利要求1或2所述的L-氨基酸脱氨酶突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5或6所述的重组细胞在制备α-酮异戊酸或含有α-酮异戊酸的化学品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种l-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如seq idno.9所示的l-氨基酸脱氨酶的第72位、第79位、第80位、第315位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
2.根据权利要求1所述的l-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，所述l-氨基酸脱氨酶突变体为，将氨基酸序列如seq id no.9所示的l-氨基酸氧化酶进行突变后得到的突变体：s72a、t79a、s80a、l315a、s72a/t79a、s72a/s80a、s72a/l315a、t79a/s80a、t79a/l315a、s80a/l315a、s72a/t79a/s80a、s72a/t79a/l315a、s72a/s80a/l315a、t79a/s80a/l315a或s72a/t79a/s80a/l315a。
3.编码权利要求1或2所述的l-氨基酸脱氨酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达了权利要求1或2所述的突变体，或携带了权利要求3所述的基因，或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
7.一种提高l-氨基酸脱氨酶酶活的方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，王玥，朱荣帅，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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