【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种基于ptls肾毒性体外预测模型及构建方法和应用。
技术介绍
1、传统毒理学安全性评价手段以动物实验为主，但动物实验存在耗时长、成本高、物种差异和伦理障碍等问题，因此寻找预测效能好的体外替代方法已成为评价外源化合物毒性亟待解决的课题之一。肾近端小管上皮细胞具有丰富的转运蛋白和代谢酶，是外源化合物引发机体肾毒性最主要的靶点。而诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells，ipscs)具有来源广泛、分化能力强、无伦理问题等独特优势，适于构建肾毒性体外替代模型。优良的体外替代模型需要恰当的指标来反映外源性化合物引发的机体毒效应，一些早期肾损伤特异性生物标志物，如肾损伤因子-1(kidney injury molecule-i，kim-1)、丛生蛋白(clusterin，clu)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，ngal)和骨桥蛋白(osteopontin，opn)在整体动物实验大鼠中表现明确，但体外实验中部分标志物的表达结果却不太一致，导致无法通过体外实验有效评价外源性化合物的肾毒性。
2、因此亟需进一步深化对体外模型的研究，研发一种具有明确、可靠的指标可以准确评价外源性化合物肾毒性的体外模型。
技术实现思路
1、基于此，有必要针对目前无法通过体外实验有效评价外源性化合物的肾毒性问题，提供一种基于ptls肾毒性体外预测模型。>
2、一种基于ptls肾毒性体外预测模型，所述体外预测模型包括由ipscs细胞定向分化的肾近端小管上皮样细胞。
3、上述基于ptls肾毒性体外预测模型，具有肾近端小管上皮细胞的形态和功能特性，在体外实验中生物标志物的表达结果与在整体动物试验中的表达结果一致，可以有效评价外源性化合物的肾毒性，是一种预测效能好的体外肾毒性评价实验用细胞模型。
4、在其中一个实施例中，用于评价肾毒性的生物标志物为opn(骨桥蛋白)。在ptls细胞模型中，早期肾损伤特异性生物标志物opn能较好的区分肾毒性化合物和非肾毒性化合物，且opn的loec(最低可观测效应浓度)值要低于ic50(半抑制浓度)值，即opn在较低的浓度下即可发现肾损伤，因此将其作为ptls模型中化合物肾毒性的评价指标。
5、本专利技术还提供了一种所述的基于ptls肾毒性体外预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞；筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物。
6、在其中一个实施例中，步骤一中，所述诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：使用y-27632因子对ipscs细胞进行培养及传代；使用分化因子bmp-2和bmp-7诱导ipscs细胞分化。
7、在其中一个实施例中，所述诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
8、使用y-27632因子对ipscs细胞进行培养及传代；将ipscs细胞转移到基质胶中，再加入2～4μl的y-27632因子，培养；加入细胞消化液，孵育后，进行传代培养，得到ipscs的传代细胞；
9、使用分化因子bmp-2和bmp-7诱导ipscs细胞分化：向上述所得的ipscs的传代细胞中加入细胞消化液，孵育后，接种细胞；培养后，加入分化因子bmp-2和bmp-7，培养后，即得由ipscs细胞定向分化的肾近端小管上皮样细胞。
10、在其中一个实施例中，所述诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
11、使用y-27632因子对ipscs细胞进行培养及传代；取ipscs细胞，离心4～6min，弃上清，加入2～4ml完全培养基重悬；将ipscs细胞悬液转移到ips培养所用基质胶中，再加入3μl/皿的y-27632因子，培养3～4天；加入0.8～1.2ml ips细胞消化液，孵育2～3min后，按比例1:3～4进行传代培养，得到ipscs的传代细胞；
12、使用分化因子bmp-2和bmp-7诱导ipscs细胞分化：向上述所得的ipscs的传代细胞中加入0.8～1.2ml accutase细胞消化液，孵育3～5min后，按照0.8*104～1*104个/cm2的密度将细胞接种在孔板中；将孔板中的细胞培养22～26h后，加入浓度为9～11ng/ml的bmp-2和浓度为2～3ng/ml的bmp-7，培养，即得由ipscs细胞定向分化的肾近端小管上皮样细胞。
13、在研发中发现，ipscs细胞的状态、细胞种板分化的密度和分化的时间长短都会影响细胞分化为肾近端小管上皮样细胞的效率。当ipscs细胞状态不佳时，种板后能贴壁生长的细胞数量则大大降低，导致启动分化的细胞密度过低，细胞融合度过低从而影响细胞分化。细胞种板分化的最佳细胞密度约为0.9ⅹ104个/cm2，细胞密度过低使细胞融合时间延长，细胞密度过高则会使细胞融合度过高，出现接触抑制现象，甚至在分化后期出现大批细胞死亡的现象。细胞分化的最适时间为7天，如果分化时间过短，细胞仍未分化为肾近端小管上皮样细胞，分化时间过长，则会使一些肾近端小管上皮细胞特异性标志物表达降低，甚至出现单层被破坏，一些细胞形成集合，甚至形成小管样结构的现象。
14、在其中一个实施例中，所述筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物采用的方法为：进行细胞活力水平检测；进行早期肾损伤特异性生物标志物的蛋白水平检测。
15、在其中一个实施例中，所述筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物采用的方法为：
16、进行细胞活力水平检测：测定添加了不同浓度参考化合物的肾近端小管上皮样细胞存活率；
17、进行早期肾损伤特异性生物标志物的蛋白水平检测：检测分别添加了不同浓度参考化合物的早期肾损伤特异性生物标志物的蛋白水平，选择opn作为ptls体外预测模型评价肾毒性的生物标志物；
18、所述参考化合物为阳性参考化合物：顺铂、庆大霉素、氯化镉、异环磷酰胺、西多福韦、5-氟尿嘧啶、卡托普利、马兜铃酸i、苯丁酮、唑来膦酸盐和阴性参考化合物：阿卡波糖、甘氨酸、维生素b6、卡铂、阿司匹林；
19、所述早期肾损伤特异性生物标志物为kim-1、ngal、clu和opn。
20、本专利技术还提供了一种所述的基于ptls肾毒性体外预测模型评价化合物肾毒性的方法，采用opn最大变化倍数和ic50值，根据logistic回归模型公式进行评价，logistic回归模型公式为：
21、y＝-47.217+22.091×opn最大变化倍数-1.189×ic50(mmol/l)，
22、当y大于临界值时，判定化合物具有肾毒性。该方法中联合应用ic50值和opn可明显提升化合物肾毒性的预测效能。
23、在其中一个实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于PTLs肾毒性体外预测模型，其特征在于，所述体外预测模型包括由iPSCs细胞定向分化的肾近端小管上皮样细胞。
2.根据权利要求1所述的基于PTLs肾毒性体外预测模型，其特征在于，用于评价肾毒性的生物标志物为OPN。
3.如权利要求1～2任一项所述的基于PTLs肾毒性体外预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述诱导iPSCs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述诱导iPSCs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物采用的方法为：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物采用的方法为：
8.如权利要求1～2任一项所述的基于PTLs肾毒性体外预测模型评价化合物肾毒性的方法，其特征在于，采用OPN最大变化
9.根据权利要求8所述的基于PTLs肾毒性体外预测模型评价化合物肾毒性的方法，其特征在于，所述临界值为以顺铂、庆大霉素、氯化镉、甘氨酸、阿卡波糖、异环磷酰胺、西多福韦、5-氟尿嘧啶、卡托普利、马兜铃酸I、苯丁酮、唑来膦酸盐、维生素B6、卡铂、阿司匹林为参考物时的Logistic回归模型预测值；所述临界值为-15.66。
10.如权利要求1～2任一项所述的基于PTLs肾毒性体外预测模型在评价镧元素肾毒性中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于ptls肾毒性体外预测模型，其特征在于，所述体外预测模型包括由ipscs细胞定向分化的肾近端小管上皮样细胞。
2.根据权利要求1所述的基于ptls肾毒性体外预测模型，其特征在于，用于评价肾毒性的生物标志物为opn。
3.如权利要求1～2任一项所述的基于ptls肾毒性体外预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述诱导ipscs细胞定向分化为肾近端小管上皮样细胞采用的方法为：
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述筛选肾近端小管上皮样细胞的早期肾损伤特异性生物标志物采用的方法为：
7.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨杏芬，陈颖思，黎姿茵，徐飞飞，池慧钦，何志妮，吴炜亮，宋佳，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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