【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、非标准蛋白(包括治疗剂和疫苗)的工程化，可能具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白——如通常在人类、其他哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的基因组中编码的——可能已经进化到在细胞环境中发挥最佳功能，但对于治疗应用而言可能不是理想的。此类蛋白的类似物可以表现出改善的生物物理、生物化学或生物学特性。蛋白类似物的益处将是实现活性增强(诸如导致高血糖条件下血糖浓度降低的代谢的代谢调节)，以及减少不利影响(例如诱导低血糖或其恶化)。
2、治疗性蛋白的实例由胰岛素提供。野生型人胰岛素和其他哺乳动物的基因组中编码的胰岛素分子与多个器官和不同类型细胞中的胰岛素受体结合，无论受体亚型是通过rna剪接的选择性模式或通过翻译后糖基化的选择性模式产生的。医学获益的实例将是可溶性胰岛素类似物的非标准设计，其对靶细胞表面上的胰岛素受体具有固有亲和力，因此其生物效力将取决于血流中葡萄糖的浓度。这样的类似物可以具有随葡萄糖浓度而改变的三维构象和/或可以具有与抑制性分子实体的共价键，其在高葡萄糖浓度下脱离。尽管本领域目前尚不知如何设计此类假定的类似物，但这类长期寻找的蛋白类似物或蛋白衍生物统称为“葡萄糖响应性胰岛素”(gri)。
3、胰岛素分子包含两条链，包含21个残基的a链，以及包含30个残基的b链。成熟激素源自较长的单链前体，称为胰岛素原，如图1a所示。图1b描绘了胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序连接肽(c-结构域)组成。同时，图1c是人胰岛素序列的示意图，包括a链和b链的二硫键连接。胰岛素分子中的特定
4、尽管胰岛素激素以zn2+稳定的六聚体形式储存在胰腺β细胞中，但它在血液中作为不含zn2+的单体发挥作用。胰岛素单体的三维结构如图2所示为带状模型。与本专利技术的逻辑相关的是b链的c末端(b30)与a链的n末端(a1)接近，通常接合成盐桥(图3a)。b链c-末端(来自b30或来自邻近残基b28、b29、b31或b32)与a链b末端的共价栓系阻断激素与胰岛素受体的结合(图3b)；这种栓系阻断受体接合的构象转换。将四个或更多个残基插入缩短的c结构域恢复受体结合和激动剂活性。因此，本文认识到，通过使用可逆的共价键合控制c-末端b链在其闭合(无活性)和开放(活性)形式下的一个或多个构像的，为配体控制的葡萄糖响应性提供了机会(图3c；chen,y.s.,等人，proceedings of the national academy ofsciences,118(30)(2021))。
5、本专利技术的一方面涉及氨基酸的手性。虽然甘氨酸是非手性的，但生物合成蛋白通常由l-氨基酸组成，其中手性中心是氨基酸的α-碳。本专利技术的特征是葡萄糖调节的构象转换的元件—即，附接至一条链的葡萄糖结合元件和附接至另一条链的二醇或一组二醇—可以附接至d-氨基酸，使得转换元件空间中的位置被优化，并且在结合葡萄糖时，对受体结合亲和力的干扰最小。本领域已知的扰乱受体结合的d-氨基酸置换的实例通过用d-ala置换glyb8来提供(nakagawa,s.等人，biochemistry 44(13),4984-99(2005))。本领域已知的增强受体结合的d-氨基酸置换的实例通过用d-phe置换pheb24提供(mirmira,r.,and tager,h.s.j.biol.chem.264(11),6349-54(1989))。与转换元件的位置相关，用d-氨基酸置换glya1通常保留受体结合亲和力，而用l-氨基酸置换glya1通常损害受体结合亲和力(wan,z.l.and liang,d.c.scientia sinica 31(12),1426-38(1988)；wan,z.l.and liang,d.c.scientia sinica 33(7),810-20(1990))。
6、长期以来，胰岛素的给药已被证实为糖尿病的治疗方法。糖尿病患者的常规胰岛素替代疗法的主要目标是严格控制血糖浓度，以防止其超出或低于健康人受试者的正常范围特征。超出正常范围的偏移与微血管疾病的长期风险增加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、目盲和肾衰竭。糖尿病患者的低血糖是胰岛素替代疗法的常见并发症，重度时可以导致显著发病率(包括精神状态改变、意识丧失、惊厥和死亡)。事实上，对此类并发症的恐惧对患者(和医生)获得严格控制血糖浓度(即在正常范围内或略高于正常范围的偏移)的努力造成主要障碍，以及在长期患有2型糖尿病的患者中，此类努力(“严格控制”)可能导致死亡率增加。除了以上重度低血糖(称为神经低血糖效应)后果外，轻度低血糖可能活化反调节机制，包括交感神经系统过度活化，导致焦虑和颤抖(称为肾上腺素能的症状)。然而，糖尿病患者可能不表现出此类警告体征，这被称为低血糖性意识障碍(hypoglycemicunawareness)的病症。轻度低血糖症的无症状增加严重低血糖及其相关的发病率和死亡率的风险。
7、低血糖的多次和反复发作还与慢性认知能力下降有关，这是长期糖尿病患者痴呆患病率增加的潜在机制。因此，迫切需要新的糖尿病治疗技术，以降低低血糖风险，同时防止血糖浓度上升至超出正常范围。
8、为了减轻使用胰岛素治疗的患者的低血糖威胁，已开发多种技术。所有此类努力的基础是建立于对患者(及其家人)进行关于低血糖症状的教育，并且在认识此类症状后，即刻摄取富含葡萄糖、蔗糖或其他快速消化形式的碳水化合物；添加有蔗糖(甘蔗糖)的橙汁就是一种实例。这种基线方法已经通过开发特定的糖尿病导向型产品而得到扩展，所述产品诸如包含包含葡萄糖的乳液的可挤压管，其可以通过口腔、咽喉、胃和小肠的粘膜的形式快速吸收。反调节激素胰高血糖素制剂以粉末形式提供，同样已开发成适合快速溶解和皮下注射的形式，作为重度低血糖的紧急治疗。胰岛素泵已与连续葡萄糖监视器相连，使得在遇到间质葡萄糖浓度的低血糖读数时停止皮下注射胰岛素并发出警报。这种基于装置的方法导致闭环系统的实验测试，其中泵和监视器与基于计算机的算法相结合，成为“人工胰腺”。...
【技术保护点】
1.一种胰岛素类似物，包括胰岛素A链和胰岛素B链，所述胰岛素A链包括与一个或多个葡萄糖结合元件共价连接的(a)在位置A1处的D-氨基酸，(b)在位置A0处的L-氨基酸或D氨基酸，或(c)在A-1处的L-氨基酸或D氨基酸，其中残基A0和A-1代表所述A链的任选N-末端延伸；并且所述胰岛素B链在所述胰岛素B链的C末端处或附近包含一个或多个二醇基团，任选地条件是位置A0和A1中的至少一个存在并且是D氨基酸。
2.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子并且共价连接至(a)在位置A-1、A0或A1处的氨基酸的侧链和/或(b)残基A-1、A0或A1的α-氨基基团。
3.权利要求1所述的胰岛素类似物，包括添加至天然胰岛素A链的N-末端的1个或2个氨基酸。
4.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述胰岛素A链的N-末端氨基酸是甘氨酸。
5.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述二醇基团连接至残基B26、B27、B28、B29、B30或C-末端延伸B31或B31-B32的侧链。
6.权利要求3所述
7.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A8处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的置换，任选地其中A8置换是选自赖氨酸、组氨酸或谷氨酰胺的含氮氨基酸。
8.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A8或位置A14处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的热力学稳定性的置换，任选地其中在位置A8或A14处的置换独立地选自由His、Lys、Arg和Glu组成的组。
9.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述A链在位置A21处包含保护所述胰岛素类似物免于化学降解的置换。
10.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,2)二醇。
11.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述B链的C末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,3)二醇。
12.权利要求5所述的胰岛素类似物，其中，所述经二醇修饰的氨基酸的在手性上可以是L或D，并且其中，其侧链包含硫醇基团或氨基基团。
13.权利要求5所述的胰岛素类似物，其进一步包含在位置B26的L多巴或位于所述B链的N-末端至C-末端氨基酸的1-3残基处的L或D多巴。
14.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链是缺失残基B30、残基B29-B30、残基B28-B30、残基B27-B30或残基B26-B30的截短的B链，二醇基团位于所述截短的B链的C末端。
15.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链延伸一个或两个氨基酸，二醇基团位于延伸的B链的C末端。
16.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，
17.权利要求16所述的胰岛素类似物，其中，
18.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
19.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
20.权利要求17所述的胰岛素类似物，其中，
21.权利要求16所述的胰岛素类似物，其中，所述带有二醇的氨基酸选自L-Cys、L-Lys、D-Lys、L-Orn、D-Orn、L-Dab和D-Dab，其经进一步修饰以包含连接至该氨基酸侧链的带有二醇的部分或经进一步修饰以用CH2OH替代羧基基团。
22.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述B链是选自由以下组成的组的多肽：
23.权利要求1-22中任一项所述的胰岛素类似物，其中，所述葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子，任选地包含苯基硼酸或卤素修饰的苯基硼酸，使得一个或多个部分选自以下：
24.一种“翻转的”胰岛素类似物，其在其他方面符合权利要求1-5，其中，含硼的葡萄糖结合元件在所述B链的C末端或附近连接，而一个或多个二醇基团在被定义为残基A-1、A0或A1的所述A链的N末端或附近连接。
25.一种通过胰蛋白酶介导的半合成制备权利要求1-23中任一项所述的类似物的方法，其中，(a)将任意任选的A链修饰(即，通过单体葡萄糖结合部分)引入胰岛素或胰岛素类似物的脱八肽[B23-B30]片段，和(b)将包含二醇的B链修饰引入长度为5-10个氨基酸残基的N-末端残基是甘氨酸的合成肽内，其在修饰后其不含胰蛋白酶切割位点。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种胰岛素类似物，包括胰岛素a链和胰岛素b链，所述胰岛素a链包括与一个或多个葡萄糖结合元件共价连接的(a)在位置a1处的d-氨基酸，(b)在位置a0处的l-氨基酸或d氨基酸，或(c)在a-1处的l-氨基酸或d氨基酸，其中残基a0和a-1代表所述a链的任选n-末端延伸；并且所述胰岛素b链在所述胰岛素b链的c末端处或附近包含一个或多个二醇基团，任选地条件是位置a0和a1中的至少一个存在并且是d氨基酸。
2.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述葡萄糖结合元件包含两个或更多个硼原子并且共价连接至(a)在位置a-1、a0或a1处的氨基酸的侧链和/或(b)残基a-1、a0或a1的α-氨基基团。
3.权利要求1所述的胰岛素类似物，包括添加至天然胰岛素a链的n-末端的1个或2个氨基酸。
4.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述胰岛素a链的n-末端氨基酸是甘氨酸。
5.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述二醇基团连接至残基b26、b27、b28、b29、b30或c-末端延伸b31或b31-b32的侧链。
6.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，所述二醇基团是主链二醇，使得c-末端氨基酸的-cooh基团被-ch2oh替代，任选地与带有二醇的部分的残基b26、b27、b28、b29、b30或c-末端延伸b31或b31-b32残基的侧链修饰组合。
7.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述a链在位置a8处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的亲和力的置换，任选地其中a8置换是选自赖氨酸、组氨酸或谷氨酰胺的含氮氨基酸。
8.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述a链在位置a8或位置a14处包含增强所述胰岛素类似物对胰岛素受体的热力学稳定性的置换，任选地其中在位置a8或a14处的置换独立地选自由his、lys、arg和glu组成的组。
9.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述a链在位置a21处包含保护所述胰岛素类似物免于化学降解的置换。
10.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述b链的c末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,2)二醇。
11.权利要求3所述的胰岛素类似物，其中，在所述b链的c末端处的所述二醇基团是脂肪族(1,3)二醇。
12.权利要求5所述的胰岛素类似物，其中，所述经二醇修饰的氨基酸的在手性上可以是l或d，并且其中，其侧链包含硫醇基团或氨基基团。
13.权利要求5所述的胰岛素类似物，其进一步包含在位置b26的l多巴或位于所述b链的n-末端至c-末端氨基酸的1-3残基处的l或d多巴。
14.权利要求1所述的胰岛素类似物，其中，所述b链是缺失残基b30、残基b29-b30、残基b28-b30、残基b27-b30或残基...
【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·A·韦斯，马克·A·雅罗辛斯基，
申请(专利权)人：印地安纳大学理事会，
类型：发明
国别省市：
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