【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针及其制备方法与应用。
技术介绍
1、甘氨胆酸水解酶(gch)又称胆酰甘氨酸水解酶，属于胆盐水解酶(bsh)的一种，主要在肠道微生物中表达，能催化肠道中结合型胆汁酸水解成游离型胆汁酸，参与胆汁酸的代谢。近年来，随着人们的生活水平不断提高，高脂高糖的饮食习惯使得糖脂代谢异常的患者明显增多。糖脂代谢异常往往还会引起肥胖、高血糖、高血脂和高胆固醇等与代谢有关的疾病。
2、有研究表明，通过抑制肠道微生物中bsh活性，降低其水解能力从而导致结合型胆汁酸增多，其为fxr的天然拮抗剂，可通过抑制肠道fxr-神经酰胺轴改善高血糖及非酒精性脂肪性肝病等。因此，开发gch抑制剂对治疗代谢性疾病具有非常重要的意义。
3、因此，如何提供一种具有高灵敏度、抗干扰能力强的适用于体内和体外检测甘氨胆酸水解酶活性的特异性荧光探针底物，为肠道菌bsh活性调节剂的研究提供高效方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出了一种高特异性、廉价易得且灵敏度高的检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针及其制备方法与应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(1)所示：
4、
5、一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
6、以无水胆酸与氨基苄醇为原
7、有益效果：本专利技术所提供的探针分子结构主要包含两个基团，其中胆酸基团是甘氨胆酸水解酶的识别基团，利于该探针分子被识别，与目的水解酶结合；以6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物为荧光基团，其水解后的游离分子能够产生较为显著的荧光信号。其次，6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物基团中的己酸片段，作为酸性基团，利于甘氨胆酸水解酶的代谢识别。此外，胆汁基团与荧光基团之间通过氨基苄醇的酰胺键结合，该酰胺键是甘氨胆酸水解酶的代谢水解位点，利于被代谢水解，释放荧光产物分子。
8、优选的，所述酰化反应过程中以dmf为溶剂，同时以hatu和dipea为催化剂。
9、更为优选的，所述酰化反应包括以下步骤：
10、将无水胆酸、hatu、dipea溶解于dmf中，室温搅拌30分钟后加入氨基苄醇，搅拌反应后萃取、干燥、减压蒸干，得到中间体1。
11、所述无水胆碱、hatu、dipea、dmf和氨基苄醇的添加量之比为1mmol：1mmol：1mmol：2ml：1mmol。
12、所述萃取为利用水和二氯甲烷为萃取液，其中，所述dmf、水和二氯甲烷的体积比为2：20：10。
13、所述搅拌反应温度为室温，时间为搅拌8-12h。
14、所述干燥过程中使用的干燥剂为无水硫酸钠。
15、有益效果：本专利技术以胆酸分子为起始原料，有效降低工艺成本，且反应过程多为室温、常压，工艺操作较为便捷。此外，本专利技术中的中间体1的产率较高，达到91.8％。
16、优选的，所述过氧化包括以下步骤：将中间体1与二氯甲烷和二氧化锰混合，室温下搅拌反应后过滤、减压蒸干，得到中间体2。
17、更为优选的，所述中间体1、二氯甲烷和二氧化锰的添加量之比为1mmol：30ml：10mmol。
18、所述搅拌反应时间为2h。
19、有益效果：中间体2无需进一步纯化，产率较高，达到82.4％。
20、优选的，所述脑文格反应包括以下步骤：将中间体2、6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物以及乙腈混合后，在保护气氛下加入哌啶，搅拌反应后蒸干溶剂并进行纯化，得到所述检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针。
21、更为优选的，所述中间体2、6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物、乙腈和哌啶的添加量之比为0.1mmol：0.2mmol：20ml：0.5ml。
22、所述搅拌反应温度为90℃，反应时间为2h。
23、所述纯化为采用硅胶柱层析纯化，且纯化过程中使用的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇以体积比10：1混合得到的混合液。
24、有益效果：本专利技术合成工艺的最后阶段，以2、6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物为后期原料，减少该原料的损失量，降低工艺成本。
25、一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针在检测甘氨胆酸水解酶活性中的应用。
26、有益效果：本专利技术中特异性荧光探针水解产物为长发射波长荧光探针，其在甘氨胆酸水解酶活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于复杂生物样本中内源性甘氨胆酸水解酶活性的定量测定。
27、一种检测甘氨胆酸水解酶的方法，包括以下步骤：利用上述荧光探针作为甘氨胆酸水解酶的特异性底物进行水解反应，再利用荧光检测定量检测单位时间内荧光信号的变化规律，以测定2-[(1e)-2-(4-氨基苯基)乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-3h-吲哚的生成率，进而定量测定甘氨胆酸水解酶的活性。
28、有益效果：上述检测过程依赖于荧光信号的检测(λ562nm)，可适用于各种类型的荧光检测仪器，尤其是荧光酶标仪等。
29、优选的，所述水解反应前，先将甘氨胆酸水解酶的反应体系进行预孵；
30、所述反应体系包括buffer缓冲液和甘氨胆酸水解酶，且甘氨胆酸水解酶浓度为0-40u/ml；
31、所述预孵温度为37℃，预孵时间为3min，预孵ph为5-6。
32、有益效果：本专利技术在接近于中性体系中对于酶活力的检测，有利于该探针应用于生物体系中酶活性的可视化检测。
33、优选的，所述水解反应中，所述荧光探针在反应体系中的浓度为10μmol/l；所述水解反应温度为37℃，时间为30min。
34、有益效果：本专利技术仅需30分钟的催化反应时间，体现了探针较快的反应速率。
35、优选的，所述荧光检测中激发波长为500nm，最大发射波长为562nm。
36、有益效果：本专利技术提供的荧光探针及其水解产物具有不同的光学属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测。
37、优选的，所述酶活性检测范围为0-40u/ml。
38、有益效果：本专利技术所提供的荧光探针与甘氨胆酸水解酶的反应体系中，荧光强度与酶活力0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、37.5、40u/ml呈现良好的酶线性关系，r2值为0.9813，说明该探针gca-dp可应用于甘氨胆酸水解酶的活力测定。
39、本专利技术公开了一种检测甘本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(1)所示：
2.如权利要求1所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述酰化反应过程中以DMF为溶剂，同时以HATU和DIPEA为催化剂。
4.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述过氧化包括以下步骤：将中间体1与二氯甲烷和二氧化锰混合，室温下搅拌反应后过滤、减压蒸干，得到中间体2。
5.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述脑文格反应包括以下步骤：将中间体2、6-(2,3,3-三甲基吲哚-1-鎓-1-基)己酸溴化物以及乙腈混合后，在保护气氛下加入哌啶，搅拌反应后蒸干溶剂并进行纯化，得到所述检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针。
6.如权利要求1所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针在检测甘氨胆酸水解酶活性中的应用。
7.一种检测甘氨胆酸水解酶
...【技术特征摘要】
1.一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(1)所示：
2.如权利要求1所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述酰化反应过程中以dmf为溶剂，同时以hatu和dipea为催化剂。
4.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述过氧化包括以下步骤：将中间体1与二氯甲烷和二氧化锰混合，室温下搅拌反应后过滤、减压蒸干，得到中间体2。
5.根据权利要求2所述的一种检测甘氨胆酸水解酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王超，马骁驰，冯磊，郭萍，武玉卓，
申请(专利权)人：大连医科大学，
类型：发明
国别省市：
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