【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的实时荧光定量pcr检测方法及其试剂盒。
技术介绍
1、小菜蛾plutella xylostella(l.)，属于鳞翅目(lepidoptera)菜蛾科(plutellidae)，一种为害十字花科蔬菜和作物的世界性农业害虫。小菜蛾最早起源于地中海地区，之后逐渐扩散到世界各地。小菜蛾以幼虫取食植物叶片进行危害，受害严重时可以造成植物只留下残存的主脉，导致蔬菜的产量和质量降低，造成重大的经济损失，因此严重威胁十字花科蔬菜作物生产，因而防治小菜蛾变得尤为重要。目前，小菜蛾的防治方法主要依赖田间喷施化学杀虫剂，在十字花科蔬菜作物主产区，通常2-3天就需要喷施一次化学杀虫剂用于防控小菜蛾。然而，大量化学杀虫剂的使用不可避免的造成十字花科蔬菜和作物农药残留，同时化学杀虫剂的大量和不合理使用也导致小菜蛾对多种不同类型的杀虫剂产生不同程度的抗药性，使得田间化学防治小菜蛾变得艰难，因此寻找新的防治方法变得尤为重要。
2、苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis,bt)是一种革兰氏阳性杆状细菌，在形成芽胞的过程中能产生多种杀虫晶体蛋白，从而高效且单一的杀死不同靶标害虫。由于bt具有杀虫谱广、高效专一且对人畜环境无害等特点，因此也使其成为目前世界上用量最大的微生物杀虫剂。同时，多种bt杀虫蛋白基因已被成功克隆并转入到多种重要经济作物中用于防治害虫。多年来，转bt经济作物在田间得到很好的推广和种植，种植面积已经超过1.9亿公顷，因此对于害虫防治和环境保护
3、荧光定量pcr技术(real time-quantitative polymerase chain reaction,rt-qpcr)是在pcr反应体系中加入荧光染料或者探针，通过收集荧光信号实时监测整个pcr进程，最终依据pcr扩增指数期荧光信号达到所设定阈值所需的循环数ct值与该模板的起始拷贝数之间的线性关系对未知模板进行定量。目前，该技术在基础科学研究、临床诊断、疾病研究和药物研发等领域广泛应用。在昆虫中，该技术应用于bt抗药性靶标基因的表达量检测。与传统的小菜蛾毒力生物测定等常规性检测手段相比，实时荧光定量pcr具有操作简便、速度快、定量准确、重复性好、特异性强、线性关系好、高通量等优点，是昆虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测首选方法，在抗药性检测上展现出巨大的应用前景。
4、因此，为了更好的监测田间小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac的抗性情况，开发出更有效的小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性检测手段，建立一种简便、快速、准确和高效的小菜蛾bt抗性检测手段就显得尤为迫切。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac抗性检测技术中存在的灵敏度低、检测周期长、重复性差及材料要求高等问题，通过特异性实时荧光定量pcr引物筛选及其反应体系的优化等步骤，建立一种快速准确的实时荧光定量pcr分子检测方法及简便、可靠、准确、快速、高效的检测小菜蛾bt抗性的检测试剂盒，为小菜蛾bt抗性有效检测提供有效工具。
2、葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase:gld)属于葡萄糖-甲醇-胆碱(glucose-methanol-choline:gmc)氧化还原酶超家族，一种黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)结合黄素蛋白，它广泛存在于各种生物体中。在昆虫中，葡萄糖脱氢酶(gld)参与葡萄糖分解代谢，从而实现碳水化合物的稳态。昆虫在受到病原菌侵染时能够激活gld活性参与昆虫宿主的细胞免疫。研究发现蜕皮激素氧化酶(ecdysone oxidase:eo)与gld同属于gmc超家族，同时eo能够将蜕皮激素(ecdysone:e)代谢成3-dehydroecdysone(3de)。此外，e能够被激活转化成20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone:20e)参与小菜蛾bt抗性。根据本申请人实验室敏感和抗性种群中肠转录组、rt-qpcr检测和基因功能分析发现，pxgld基因表达量的降低与bt杀虫蛋白cry1ac抗性密切相关。因此利用rt-qpcr技术检测pxgld基因表达量的下降水平则可以作为一种有效检测小菜蛾对bt cry类杀虫蛋白抗性有效方法。与bt杀虫蛋白cry1ac受体基因相比，pxgld基因能够调控20e的含量差异调控bt杀虫蛋白cry1ac受体基因表达量的变化，因此基于pxgld基因设计的检测试剂盒会更加灵敏。此外，在设计pxgld基因检测引物时，通过将pxgld基因比对到ncbi数据库中，获得pxgld基因的特异性片段后进行引物设计，同时所设引物的扩增效率值必须在95-105区间。因此该引物能够特异的检测到小菜蛾bt杀虫蛋白cry1ac敏感和抗性种群中pxgld基因表达情况。重要的是，基于pxgld基因开发的小菜蛾早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗药性风险评估、监测预警和抗性治理措施评价提供技术手段，同时在减少害虫危害、保护生态环境、增加农民经济收入和保障人类饮食结构等方面具有重要的意义。
3、本专利技术提供的技术方案是：
4、首先，本专利技术提供一种用于检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的特异性pcr引物对，所述引物对的正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示。
5、所述特异性引物对是以小菜蛾四龄幼虫中肠葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶超家族(gmc)中葡萄糖脱氢酶亚家族pxgld基因的保守片段区为靶标序列设计得到的靶标基因特异性引物对。
6、本专利技术还提供一种用于检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含所述的特异性pcr引物对。
7、进一步地，本试剂盒中还包括本专利技术人实验室已发表的以小菜蛾持家基因核糖体蛋白rpl32基因的保守片段区为靶标序列设计得到的内参基因rpl32特异性引物序列(正向引物序列：5′-ccaatttaccgccctacc-3′；反向引物序列：5′-taccctgttgtcaatacctct-3′)，用于校正样品间实验误差。本试剂盒中含有特异性引物，逆转录酶，dnase，rnase抑制剂，dntp混合物，mgcl2溶液，热启动taq dna聚合酶，荧光定量反应液，buffer缓冲液，rnase-free水等。此外，本试剂盒还包括符合该试剂盒要求的阳性对照及阴性对照样品。
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1.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的特异性PCR引物对，其特征在于：所述引物对的序列为：正向引物序列如SEQ ID NO. 2所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性PCR引物对。
3.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含内参基因RPL32特异性引物。
4.如权利要求3所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述内参基因RPL32特异性引物的正向引物序列：5′-CCAATTTACCGCCCTACC-3′；反向引物序列：5′-TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3′。
5.一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其特征在于：其采用如权利要求1所述的引物对或权利要求2至4任一项所述的试剂盒进行PCR，具体包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95 °C预变性10 m
7.如权利要求5所述的PCR检测方法，其中，PCR过程完成后，按1.6 °C•s-1的升温速率从72 °C升至95 °C进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95 °C进行15 s，然后60 °C进行1min，按0.15 °C•s-1的升温速率从60 °C升至95 °C，最后95 °C进行1 s。
8.如权利要求5至7任一项所述的PCR检测方法，其特征在于：所述待测小菜蛾的RNA样品为小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品。
...【技术特征摘要】
1.一种检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的特异性pcr引物对，其特征在于：所述引物对的序列为：正向引物序列如seq id no. 2所示，反向引物序列如seq id no. 3所示。
2.一种检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的特异性pcr引物对。
3.如权利要求2所述的pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含内参基因rpl32特异性引物。
4.如权利要求3所述的pcr检测试剂盒，其特征在于：所述内参基因rpl32特异性引物的正向引物序列：5′-ccaatttaccgccctacc-3′；反向引物序列：5′-taccctgttgtcaatacctct-3′。
5.一种检测小菜蛾对bt杀虫蛋白cry1ac抗性的pcr检测方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭兆将，朱流红，程周强，董丽娜，郭乐，白杨，张友军，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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