【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物制剂的，尤其涉及一种载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，以及制备方法，还有该载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的应用。
技术介绍
1、小核酸药物一般由30个以内碱基或碱基对组成，主要以mrna为靶点来调控蛋白的表达，包括sirna、适配体（aptamer）、微小rna（mirna））等，其具有临床前研发周期短，高特异性、高效性等优势，可从基因水平实现疾病的精准治疗。然而，小分子核酸药物在体内循环中不稳定，易被降解，若要实现体内精准转染需要设计构建靶向载体。目前常用的载体主要包括病毒型载体及非病毒性载体两大类，其中病毒型载体转染效率较高但应用安全性较差，且不具备靶向性，临床转化受限。非病毒型载体包括阳离子脂质体、聚乙烯亚胺等阳离子复合物，主要利用电荷吸附原理将核酸吸附在载体表面，形成稳定携载，然而这几类纳米载体普遍缺乏疾病区域特定调控细胞的特异性靶向功能，且在与细胞结合吞噬后，无法避免溶酶体吞噬消化，导致最终转染效率低下。若要实现基于小核酸药物的疾病精准治疗，其纳米载体除需具有突破体内生物屏障达到疾病区域的靶向能力外，还需具有安全高效的细胞内核酸释放能力。
2、超声靶向微泡爆破技术 (ultrasound-targeted microbubble destruction,utmd)是近年来一项新的快速发展的介导基因转染方法，当使用微泡或超声相变纳米粒为载体时，载体内部形成的气核可在声场所产的的区域压力变换下爆破并向外释放能量，瞬间在细胞膜表面形成可逆性孔洞，形成“声孔效应”， 其内部或表面所携载核酸可
3、目前微泡及超声相变纳米粒仍然主要以电荷吸附原理携载小核酸药物，阳离子基因载体容易在血液中吸附蛋白，血液相容性有待改善，易被免疫细胞较快地捕获清除，这使得达到靶细胞的数量较少，生物仿生纳米技术是近年来纳米递药技术的又一突破性进展，仿生纳米粒是一种通过细胞膜来包被载基因或载药纳米粒的技术，可通过其表面细胞膜涂层改变纳米-生物界面特性，模仿内源性细胞通过细胞膜介导的生物学行为，达到不同的诊疗目的。同时内源性细胞膜可覆盖纳米粒表面吞噬及免疫系统识别位点，可显著延长纳米粒血液循环时间。
4、然而采用仿生纳米技术结合utmd技术的基因载体目前尚未见到报导。其主要原因为核酸作为水溶性材料无法溶解于纳米粒内部包裹的液态氟碳或微泡内部包裹的气体中，因此需要制备阳离子脂质纳米粒利用电荷吸附原理将microrna吸附在纳米粒表面，而仿生纳米粒制备技术是将细胞膜包被在纳米粒表面，其制备过程要求纳米粒核心表面电位为负电位，若要使用阳离子纳米粒为核心制备仿生纳米粒，在与细胞膜混合的过程中，纳米粒与细胞膜会因为电荷吸附作用互相交联而形成结构复杂的复合物，无法制备具有稳定核-壳结构、外壳厚度均一的仿生纳米粒。因此，有必要采取新策略对小核酸药物载体制备方法及功能进行改进。
技术实现思路
1、为克服现有技术的缺陷，本专利技术要解决的技术问题是提供了一种载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒制备方法，其能够同时携载小分子核酸及细胞膜，能够作为体内基因转染载体。
2、本专利技术的技术方案是：这种载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，其表面通过电荷吸附原理连接小分子核酸，表面脂质层成分中混入细胞膜成分，纳米粒内部包裹pfp，在超声辐照下发生液-气相变，并在持续超声辐照下发生爆破，产生的爆破能量在细胞膜表面形成可逆性声孔，爆破后所释放的药物在爆破驱动力推动下通过声孔直接进入细胞内部，实现细胞内的核酸高效释放及转染。
3、还提供了载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其包括以下步骤：
4、（1）阳离子超声相变纳米粒制备：将二硬脂酰磷脂酰胆碱dspc、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺dspe、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷dotap混合溶于二氯甲烷，置于旋转蒸发仪获得一层均匀的半透明薄膜，加入超纯水，置于超声清洗机内使薄膜完全洗脱形成均质半透明的混悬液，将混悬液移至离心管内，冰上预冷，加入超声相变材料，使用超声振荡后得到的半透明的混悬液成为不透明的乳液而得到纳米粒初乳液，低温高速离心多次后除多余杂质，得到纯化的阳离子超声相变纳米粒；
5、（2）载小核酸药物超声相变纳米粒的制备：将步骤（1）中制备得到的阳离子超声相变纳米粒与小分子核酸混合后置于冰上共孵育，通过电荷吸附作用将核酸连接于脂质纳米粒表面，同时在脂质纳米粒表面形成电荷反转，制备得到载小核酸药物超声相变纳米粒；
6、（3）载小核酸药物仿生超声相变纳米粒制备：将细胞膜与（2）步骤中获得的载小核酸药物超声相变纳米粒混合，通过声振法利用脂质膜流动性将细胞膜成分加入到纳米粒脂质壳成分中，混合物置于冰浴中，向其中再次加入pfp，超声振荡后得到载小核酸药物仿生超声相变纳米粒，低温高速离心多次后除多余杂质，得到纯化的载小核酸药物仿生超声相变纳米粒。
7、本专利技术以阳离子脂质体为核心，通过电荷吸附作用反转纳米粒表面电荷后，利用细胞膜脂质层所具有的流动性，通过超声振动使纳米粒破碎重组，将细胞膜整合在载基因纳米粒表面，最终制备得到载基因仿生超声相变纳米粒，其能够同时携载小分子核酸及细胞膜，能够作为体内基因转染载体。
8、还提供了所述载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒在急性心肌梗死、心脏移植后急性排斥反应，乳腺癌肺转移及结肠癌肝转移疾病的靶向治疗中应用。
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1.载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，其特征在于：其表面通过电荷吸附原理连接小分子核酸，表面脂质层成分中混入细胞膜成分，纳米粒内部包裹PFP，在超声辐照下发生液-气相变，并在持续超声辐照下发生爆破，产生的爆破能量在细胞膜表面形成可逆性声孔，爆破后所释放的药物在爆破驱动力推动下通过声孔直接进入细胞内部，实现细胞内的核酸高效释放及转染。
2.根据权利要求1所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，其特征在于：所述脂质纳米粒成分包括二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP三种脂质成分，其中1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷DOTAP携带阳离子成分；所述细胞膜选择红细胞膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、中性粒细胞膜、肿瘤细胞膜；所述小核酸药物选择siRNA、反义寡核苷酸ASO、适配体Aptamer、微小RNAmiRNA和小激活RNAsaRNA。
3.根据权利要求1所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的载基因及细胞膜超声响应性脂
5.根据权利要求4所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述超声振荡使用声波细胞震碎仪条件设置为90W，时间共5min，占空比50%；旋转蒸发仪条件设置为温度60℃，旋转时间1h；使用低温高速离心机反复离心纯化，每次离心条件设置为转速12000rpm，离心时间15min，共离心3次。
6.根据权利要求5所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，加入相变材料为液态全氟戊烷PFP，化学式C5F12，分子质量288.036g/mol，戊烷的全氟化类似物，环境温度达到29℃时发生液-气相变。
7.根据权利要求6所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，阳离子超声相变纳米粒与小分子核酸按照电荷比3:2进行共孵育。
8.根据权利要求7所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，小核酸药物为siRNA或microRNA中的至少一种；阳离子超声相变纳米粒与小核酸药物冰上共孵育时间为30-40min；阳离子超声相变纳米粒粒径为300-400nm。
9.根据权利要求8所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，载小核酸药物超声相变纳米粒与细胞膜以磷脂与膜蛋白质量比1：1的比例混合；声震前加入PFP的量为200μl，加入油相以增加仿生纳米粒制备成功率；超声振荡使用声波细胞震碎仪条件设置为90W，时间共5min，占空比50%；低温高速离心多次后除多余杂质，每次离心条件设置为转速12000rpm，离心时间15min，共离心3次。
10.根据权利要求1所述载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒在急性心肌梗死、心脏移植后急性排斥反应，乳腺癌肺转移及结肠癌肝转移疾病的靶向治疗中应用。
...【技术特征摘要】
1.载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，其特征在于：其表面通过电荷吸附原理连接小分子核酸，表面脂质层成分中混入细胞膜成分，纳米粒内部包裹pfp，在超声辐照下发生液-气相变，并在持续超声辐照下发生爆破，产生的爆破能量在细胞膜表面形成可逆性声孔，爆破后所释放的药物在爆破驱动力推动下通过声孔直接进入细胞内部，实现细胞内的核酸高效释放及转染。
2.根据权利要求1所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒，其特征在于：所述脂质纳米粒成分包括二硬脂酰磷脂酰胆碱dspc、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺dspe、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷dotap三种脂质成分，其中1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷dotap携带阳离子成分；所述细胞膜选择红细胞膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、中性粒细胞膜、肿瘤细胞膜；所述小核酸药物选择sirna、反义寡核苷酸aso、适配体aptamer、微小rnamirna和小激活rnasarna。
3.根据权利要求1所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，脂质成分二硬脂酰磷脂酰胆碱（dspc）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（dspe）,1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷（dotap），质量配比为10:4:2。
5.根据权利要求4所述的载基因及细胞膜超声响应性脂质纳米粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述超声振荡使用声波细胞震碎仪条件设置为90w，时间共5min，占空比50%；旋转蒸发仪条件设置为温度60℃，旋...
【专利技术属性】
技术研发人员：冷晓萍，王卓，孙萍，汪佳旭，赵晨，李守强，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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