促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物技术

本文披露了用于使用基因组工程化技术产生促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的细胞系的方法和组合物

【技术实现步骤摘要】
促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是申请号为
201880049275.0、
申请日为
2018
年6月2日
、
专利技术名称为“促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为
PCT/US2018/035764
的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为
2017
年6月2日，申请号为
62/514,754
的美国临时专利申请的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文
。
[0003]序列表
[0004]本申请含有已经以
ASCII
格式经由
EFS
‑
Web
递交的序列表并且将该序列表通过引用以其整体并入本文
。
创建于
2018
年5月
29
日的
ASCII
副本被命名为
AMBX_0223_PCT_SL.txt
，并且大小是
13,172
字节
。


[0005]本披露内容涉及产生含非天然氨基酸的多肽的细胞系的基因组工程化和产生的领域
。
本专利技术总体上涉及细胞系的产生
、
开发和含非天然氨基酸的多肽和蛋白质的产生的领域
。

技术介绍

[0006]化学正交定向的工程化系统在真核细胞中的应用
(EuCODE)(Feng
等人
,(2013),A general approach to site
‑
specific antibody drug conjugates[
位点特异性抗体药物缀合物的一般方法
],PNAS[
美国国家科学院院刊
]111(5):1766
‑
1771
；
Schultz
等人
,USPN 7,083,970
，各自通过引用并入本文
)
是基因地产生含有非天然氨基酸的蛋白质方面的突破
。
近年来，这项技术已经在抗体药物缀合
(ADC)
领域中取得了快速的发展
(
参见例如，美国专利申请号
20150018530、20150141624、20150152187
和
20150152190)
，各自通过引用并入本文
。
然而，在哺乳动物细胞中相对较低的产量阻碍了含非天然氨基酸的蛋白质在工业中更广泛的应用
。
[0007]观察结果表明，可能导致蛋白质产生的产量低的主要因素可能是由系统中过量的不带电
tRNA
引起的诱导的细胞凋亡
。
如本领域已知的，细胞凋亡可以由在细胞培养
(
包括生产过程
)
中的各种内在或外在因素引发
。
导致蛋白质产生的产量低的其他挑战是能够在生物反应器过程中放大时激活固有的凋亡途径的细胞应激物
。
因此，在工业上需要用于促进和增加含非天然氨基酸的蛋白质产生的改进的方法和组合物
。
本专利技术披露内容满足了这些和其他需求，如通过阅读以下披露内容所显而易见的
。

技术实现思路

[0008]本文披露了用于促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物
。
本文还披露了用于促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的细胞和细胞系
。
在一个实施例中，本专利技术披露内容提供了一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞系的方法，该方法包括在表达
含选择密码子的目的基因的细胞中一个或多个靶向失活的位点或区域，其中细胞包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)
和正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)。
在另一个实施例中，该细胞或细胞系是真核的
。
在其他实施例中，该细胞或细胞系选自
COS、CHO、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28
‑
G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0
‑
Ag14、HeLa
或
HEK293。
在一个其他实施例中，该细胞或细胞系是瞬时的
、
稳定的细胞群或稳定的克隆细胞系
。
在另一个实施例中，该细胞是分离的细胞
。
该分离的细胞用于获得掺入非天然氨基酸的蛋白质
。
[0009]在另一个实施例中，本专利技术包括掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽
。
在其他实施例中，该非天然氨基酸是位点特异性掺入的
。
在另一个实施例中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸
、
对硝基苯丙氨酸
、
对磺基酪氨酸
、
对羧基苯丙氨酸
、
邻硝基苯丙氨酸
、
间硝基苯丙氨酸
、
对硼羰基
(p
‑
borony)
苯丙氨酸
、
邻硼羰基苯丙氨酸
、
间硼羰基苯丙氨酸
、
对氨基苯丙氨酸
、
邻氨基苯丙氨酸
、
间氨基苯丙氨酸
、
对酰基苯丙氨酸
、
邻酰基苯丙氨酸
、
间酰基苯丙氨酸
、
对
OMe
苯丙氨酸
、
邻
OMe
苯丙氨酸
、
间
OMe
苯丙氨酸
、
对磺基苯丙氨酸
、
邻磺基苯丙氨酸
、
间磺基苯丙氨酸
、5
‑
硝基
His、3
‑
硝基
Tyr、2
‑
硝基
Tyr、
硝基取代的
Leu、
硝基取代的
His、
硝基取代的
De、
硝基取代的
Trp、2
‑
硝基
Trp、4
‑
硝基
Trp、5
‑
硝基
Trp、6
‑
硝基
Trp、7
‑
硝基
Trp、3
‑
氨基酪氨酸
、2
‑
氨基酪氨酸
、
邻磺基酪氨酸
、2
‑
磺基氧基苯丙氨酸
、3
‑
磺基氧基苯丙氨酸
、
邻羧基苯丙氨酸
、
间羧基苯丙氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞系的方法，该方法包括在表达含选择密码子的目的基因的细胞中一个或多个靶向失活的位点或区域，其中细胞包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)
和正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)。2.
如权利要求1所述的方法，其中该细胞或细胞系是真核的
。3.
如权利要求1所述的方法，其中该细胞或细胞系选自
COS、CHO、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28
‑
G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0
‑
Ag14、HeLa
或
HEK293。4.
如权利要求1所述的方法，其中该非天然氨基酸选自
O
‑
甲基
‑
L
‑
酪氨酸
、L
‑3‑
(2
‑
萘基
)
丙氨酸
、3
‑
甲基
‑
苯丙氨酸
、O
‑4‑
烯丙基
‑
L
‑
酪氨酸
、4
‑
丙基
‑
L
‑
酪氨酸
、
对炔丙基氧基
‑
L
‑
苯丙氨酸
、
三
‑
O
‑
乙酰基
‑
GlcNAc
β
‑
丝氨酸
、
左旋多巴
、
氟化苯丙氨酸
、
异丙基
‑
L
‑
苯丙氨酸
、
对叠氮基
‑
L
‑
苯丙氨酸
、
对酰基
‑
L
‑
苯丙氨酸
、
对苯甲酰基
‑
L
‑
苯丙氨酸
、L
‑
磷酸丝氨酸
、
膦酰基丝氨酸
、
膦酰基酪氨酸
、
对碘
‑
苯丙氨酸
、
对溴苯丙氨酸
、
对氨基
‑
L
‑
苯丙氨酸或异丙基
‑
L
‑
苯丙氨酸
。5.
如权利要求1所述的方法，其中该目的基因是生物治疗基因或产物
。6.
如权利要求1所述的方法，其中该生物治疗基因或产物是疫苗
。7.
如权利要求1所述的方法，其中该目的基因是抗体
、scFv、scFv
融合蛋白
、Fc
融合蛋白
、
因子
VII、
因子
VIII
或因子
IV。8.
如权利要求1所述的方法，其中该目的基因是抗体
。9.
如权利要求1所述的方法，其中该目的基因是细胞因子
、
白细胞介素
、
干扰素
、
趋化因子
、
生长因子
、
激素
、
及其受体
、
类似物
、
双特异物或片段
。10.
如权利要求1所述的方法，其中该目的基因是
HER2、CD
‑
70、PSMA、5T4、EGFR、TROP2、CD3、IL
‑
2、IL
‑
3、IL
‑
10、IL
‑
15、GPC3、DLL3、ROR1、
瘦素
、FGF
‑
21、FGF
‑
23、HGH、FcR、
胰岛素
、TNFR1、TRAIL、EPO、
及其类似物
、
双特异物或片段
。11.
如权利要求1所述的方法，其中该一个或多个靶向失活的位点或区域是
GS、Bcl
‑
2、IGFBP4、AQP1、Maf1、eRF1、FUT8、P53、
半胱天冬酶
3、UPF1、Smg1、Smac/DIABLO、Apaf
‑
1、
半胱天冬酶
‑
6、
半胱天冬酶
‑
7、
半胱天冬酶
‑
9、
半胱天冬酶
‑
10、PARP、
α
胞衬蛋白
、NuMA、AIF、CAD、Puma、Noxa、14
‑3‑
3、Aven、Myc
或
HtrA2/Omi。12.
如权利要求1所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域是非固有选择标记基因
。13.
如权利要求1所述的方法，其中该选择标记基因是博莱霉素
、
潮霉素或嘌呤霉素
。14.
如权利要求1所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域是
Bcl
‑2位点或区域
。15.
如权利要求1所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域是
Bax
或
Bak。16.
如权利要求1所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域被完全或部分失活
。17.
如权利要求1所述的方法，其中该选择密码子是无义密码子
、
稀有密码子或四碱基密码子
。18.
如权利要求
15
所述的方法，其中该选择密码子包含赭石密码子
、
乳白石密码子或琥珀密码子
。19.
如权利要求1所述的方法，该方法包括掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽
。20.
如权利要求1所述的方法，其中该非天然氨基酸是位点特异性掺入的
。21.
如权利要求1所述的方法，其中该细胞或细胞系是瞬时的
、
稳定的细胞群或稳定的克隆细胞系
。
22.
如权利要求1所述的方法，该方法用于降低或减少细胞或细胞系中的细胞凋亡
。23.
如权利要求1所述的方法，该方法用于改进掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽的产量
。24.
一种如权利要求1所述的方法的分离的细胞
。25.
如权利要求
22
所述的分离的细胞，该分离的细胞用于获得掺入非天然氨基酸的蛋白质
。26.
一种用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞或细胞系，该细胞表达含选择密码子的目的基因，其中该目的基因包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)
和正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)
；并且其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域
。27.
一种用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞或细胞系，该细胞或细胞系包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)、
正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)
，并且其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域
。28.
一种表达目的基因的细胞或细胞系，该目的基因包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)、
正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)
，其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域
。29.
一种降低或减少包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)
和正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)
的细胞中的细胞凋亡的方法，该方法包括使在该细胞中的一个或多个促凋亡位点或区域靶向失活
。30.
一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞的方法，该方法包括：提供能够使细胞中的一个或多个靶向失活的位点或区域失活的核酸分子，该细胞表达含选择密码子的目的基因；以及将该核酸分子引入表达该含选择密码子的目的基因的细胞中，该目的基因包含正交氨酰基
tRNA
合成酶
(O
‑
RS)
和正交抑制型
tRNA(O
‑
tRNA)。31.
如权利要求
30
所述的方法，其中核酸分子选自
SEQ.ID NO.1
‑
42。32.
如权利要求
30
所述的方法，其中该核酸分子使一个或多个靶向失活的位点或区域失活
。33.
如权利要求
30
所述的方法，其中该一个或多个靶向失活的位点或区域是相同或不同的
。34.
如权利要求
30
所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域是
GS、Bcl
‑2家族
、IGFBP4、AQP1、Maf1、eRF1、FUT8、P53、
半胱天冬酶
3、UPF1、Smg1、
博莱霉素
、
潮霉素
、
嘌呤霉素
、Smac/DIABLO、Apaf
‑
1、
半胱天冬酶
‑
6、
半胱天冬酶
‑
7、
半胱天冬酶
‑
9、
半胱天冬酶
‑
10、PARP、
α
胞衬蛋白
、NuMA、AIF、CAD、Puma、Noxa、14
‑3‑
3、Aven、Myc
或
HtrA2/Omi。35.
如权利要求
30
所述的方法，其中该靶向失活的位点或区域是非固有选择标记基因
。36.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈思耕，卢迎春，田丰，
申请(专利权)人：AMBRX，
类型：发明
国别省市：