近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法技术

本申请属于动物模型领域，具体涉及一种近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法

【技术实现步骤摘要】
近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法


[0001]本申请属于动物模型领域，具体涉及一种近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法
。

技术介绍

[0002]荧光标记蛋白被广泛用于检测基因表达和细胞谱系追踪，但仍然存在很多问题与不足
。
在评估荧光蛋白的特定实验用途时，考虑许多特征是至关重要的，其中包括：光
/
温度稳定性
、
颜色强度
、
细胞毒性和免疫原性
。GFP(
绿色荧光蛋白
)
作为一种细胞标记工具，为科研人员提供了一种研究基因表达和细胞谱系追踪的有可视化方法，大力推动了生命科学研究进展
。
然而，有研究报道，
GFP
蛋白的免疫原性和细胞毒性可能会混淆对体内实验数据的解释，造成实验结果的假阳性或者假阴性
。
[0003]来自细菌植物色素光感受器
(BphP)
的遗传编码荧光蛋白
(genetically encodable fluorescent proteins
，
FPs)
的最新发展显着推进了深层组织和全身成像
。
与远红绿色荧光蛋白
(Green fluoresence protein
，
GFP)
样
FP
相比，基于
BphP
的
FP
在近红外组织透明度“光学窗口”(
约
650
>‑
900nm)
附近或内部被激发和荧光，其中背景自发荧光低，光散射减少，血红蛋白，黑色素和水的组合吸收最小
。
已经表明，基于
BphP
的
NIR FP
可以通过用
GAF
结构域中
‑
PIH
‑
基序中的
Cys
替换
Ile
残基来获得
。
这种
Cys
残基能够与
BV
形成共价键，从而产生
40nm
光谱蓝移
。
通过用原始的
Ile
替换这个
Cys
，蓝移
NIR FP
可以转换为标准的红移
NIR FP
，其中
BV
与
PAS
域中的保守
Cys
残基结合，因此获得了在
GAF
域中具有
Cys
的单体近红外荧光蛋白
(monomeric NIR FP
，
miRFP670)
，激发波长为
642nm
，发射波长为
670nm。
[0004]研究具有
600nm
以上发射波长的荧光蛋白主要有两个目的：首先，在生物成像技术中很需要能够在近红外
(Near infrared
，
NIR)
窗口
(650
‑
900nm)
内具有发射光的荧光蛋白，因为光照射穿透组织时，其中的生物分子如黑色素
、
血红蛋白和水，在近红外窗口的光具有最小的吸收；其次，这种荧光蛋白能为多波长成像技术提供更多的选择，其应用于生物体内的成像技术能产生更少的光毒性
。
虽然，科学家们在寻找远红外红色荧光蛋白做出了不少尝试，领域内还缺乏非常稳定并被广泛应用的体内体外报告体系
。
其原因除了是荧光光谱学稳定性以外，还需要系统性的评价体内细胞命运谱系追踪的稳定性，特异性，与已有遗传标记系统的兼容性等
。
[0005]而目前尚未存在近红外荧光蛋白转基因动物模型能够与光声系统兼容
。

技术实现思路

[0006]基于此，本申请提供一种能够与光声系统兼容的近红外荧光蛋白转基因动物模型的构建方法
。
[0007]本申请一方面提供一种近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0008]利用基因编辑技术在小鼠受精卵的
11
号染色体的
H11
位点敲入
emiRFP
基因，构建
重组受精卵；所述
emiRFP670
基因的序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
[0009]将所述重组受精卵导入到代孕鼠孕育，从出生幼鼠中选出阳性小鼠，获得
F0
代小鼠
。
[0010]所述
F0
代小鼠与野生型鼠交配，从出生幼鼠中筛选出阳性杂合子
F1
代鼠作为近红外荧光蛋白转基因小鼠模型
。
[0011]在其中一个实施例中，基因编辑技术包括：
BE3
，
CRISPR/Cas9
，
TALEN
和
ZFN。
[0012]在其中一个实施例中，构建重组受精卵包括：根据
emiRFP670
基因的序列，设计并获得
sgRNA
，将所述
sgRNA
与
Cas9
蛋白共同孵育，制备
Cas9/sgRNA
混合物，采用
Cre
‑
LoxP
表达系统构建携带条件性过表达
emiRFP670
序列的同源重组打靶载体，将所述打靶载体
、Cas9/sgRNA
混合物注射到小鼠受精卵中
。
[0013]本申请另一方面还提供所述的构建方法得到的近红外荧光蛋白转基因小鼠模型在光声成像系统中的应用
。
[0014]本申请还提供所述构建方法建立的近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的组织
。
[0015]本申请还提供所述构建方法建立的近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的器官
。
[0016]本申请另一方面还提供特异靶向小鼠
11
号染色体的
H11
位点所述
sgRNA
，其序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0017]本申请另一方面还提供含有所述
sgRNA
的
CRISPR/Cas9
打靶载体
。
[0018]本申请另一方面还提供所述的
sgRNA
或所述的
CRISPR/Cas9
打靶载体在特异识别和靶向修饰小鼠
11
号染色体的
H11
位点中的应用
。
[0019]在其中一个实施例中，所述靶向修饰为基因敲除
、
基因转入或定点过表达内源基因
。
[0020]本申请另一方面还提供所述的
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用基因编辑技术在小鼠受精卵的
11
号染色体的
H11
位点敲入
emiRFP
基因，构建重组受精卵；所述
emiRFP670
基因的序列如
SEQ ID NO.1
所示；将所述重组受精卵导入到代孕鼠孕育，从出生幼鼠中选出阳性小鼠，获得
F0
代小鼠；所述
F0
代小鼠与野生型鼠交配，从出生幼鼠中筛选出阳性杂合子
F1
代鼠作为近红外荧光蛋白转基因小鼠模型
。2.
根据权利要求1所述的近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，基因编辑技术包括：
BE3
，
CRISPR/Cas9
，
TALEN
和
ZFN。3.
根据权利要求1所述的近红外荧光蛋白转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，构建重组受精卵包括：根据
emiRFP670
基因的序列，设计并获得
sgRNA
；将所述
sgRNA
与
Cas9
蛋白共同孵育，制备
Cas9/sgRNA
混合物；采用
Cre
‑
LoxP
表达系统构建携带条件性过表达
emiRFP67...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚茂金，威智慧，王钟兴，任娇艳，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：