一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种CHD1L
flox/flox
小鼠模型的构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及动物模型构建
，具体涉及一种
CHD1L
flox/flox
小鼠模型的构建方法与应用
。

技术介绍

[0002]目前对于炎症性疾病
、
癌症的治疗仍是需要克服的难题，需要加大力度对各种特异抗原的寻找，对有关炎症性疾病和癌症等的临床前研究有助于发现疾病检测和治疗的靶标及相关药物研发，有利于对人类的疑难杂症进行攻克
。
在此过程中构建了大量的基因工程小鼠进行基因功能
、
疾病发展规律的探索，在药物研发中发挥了重要作用
。
[0003]1q21
的扩增是许多实体肿瘤中最常见的遗传改变之一，如膀胱癌
、
乳腺癌
、
肝细胞癌
、
结肠癌
、
食管癌
、
骨纤维肉瘤等
。
在肝癌细胞染色体
1q21
中发现并命名的色域解旋酶
/ATP
酶
DNA
结合蛋白1样基因
(CHD1L)(
马宁芳等，
2008
年
)
在肝细胞癌
(HCC)
中异常高度扩增，与肿瘤的恶性增殖和预后不良显著相关
。
目前已发现
CHD1L
在多种肿瘤中高度特异表达，如膀胱癌
、
乳腺癌r/>、
肝细胞癌
、
结肠癌
、
食管癌
、
骨纤维肉瘤等
。CHD1L
基因，又名
ALC1(
染色质域解旋酶
/ATP
酶
DNA
结合1样蛋白基因
)
，位于
chr1q21.1
，全长
53kb
，
23
个外显子
。CHD1L
是通过与
DNA
结合来调节染色体完整性维持
、DNA
修复和转录调节
。CHD1L
的
C
端具有一段与
CHD1
识别甲基化组蛋白尾巴的染色体结构域不同的
Macrodomain
结构域，
Macrodomain
可以特异性识别聚
ADP
‑
核糖
(PAR)
结构
。
聚
ADP
‑
核糖聚合物
(poly ADP
‑
ribose polymer
，
PAR)
，也称为
PAR
化修饰
(PARylation modification)
，是由
PAR
聚合酶
(PARPs)
产生的一种表观修饰形式，当单链
DNA
断裂
(SSB)
发生时可激活
PARP
活性进行
PAR
化标记，以参与
DNA
损伤和修复以及染色质重塑相关的翻译后修饰过程
。CHD1L
的
C
端的
Macrodomain
宏结构域是一个
ADP
‑
核糖
/PAR
结合元件的聚合物，因此
CHD1L
具有
PAR
依赖性染色质重塑活性，促进
DNA
断裂修复
。
当
SSB
的发生造成了碱基切除修复，引起染色体构像松弛，激活了
PARP
酶，使在断链处形成聚
ADP
‑
核糖基化
(PARylation)
，
CHD1L
被吸引招募到核小体中，与染色质相关的聚
ADP
‑
核糖
‑
PARP1
相互作用促进染色体的修复
。
[0004]CHD1L
在多种细胞高表达，尤其在肿瘤发生时，肿瘤本身和肿瘤微环境中的免疫细胞中均有高度扩增，对于
CHD1L
的异常表达对肿瘤细胞与免疫细胞各自的作用及它们之间的交互影响机制仍属于未知
。
现有研究多聚焦于
CHD1L
基因在肿瘤发生中的作用，其在免疫细胞中的作用却鲜有报道
。
通过查询在线数据库资料和前期实验数据证实，
CHD1L
在
B、T、NK
等淋巴细胞中有高表达，参与调控免疫细胞的增殖
、
活化
、
分化及迁移
。
[0005]B
淋巴细胞是一群具有不同功能亚群的异质群体，它能在周围淋巴器官中特异识别抗原并处理
、
提呈抗原启动适应性免疫应答，通过分化成浆细胞分泌特异抗体
、
中和抗原参与体液免疫，消灭病原体，维持机体的免疫平衡
。
为对应抗原的多样化，
B
淋巴细胞产生抗体的多样化是机体能够识别并有效清除抗原的生物学基础
。B
淋巴细胞主要依赖两种机制产生多样化抗体，一个是重组激活基因
(RAG)
编码的重组酶等主导的基因重排；另一个是胞苷脱氨酶
(AID)
等主导的体细胞高频突变
(SHM)。
获得抗原活化的
B
细胞激活
RAG
重组酶介导
了免疫球蛋白
(Ig)
重链基因座内
VDJ
片段的重排导致抗体类别转换
(CSR)
，随后在滤泡区
AID
的活化介导了
V
区内互补决定区
(CDR)
基因发生体细胞高频突变
(SHM)
，
SHM
不仅能增加抗体类别多样化，而且可导致更高亲和力的抗体产生
。
在分子水平上，
CSR
是一种体细胞重组反应，通过
Ig
重链
(IgH)
位点内
DNA
双链断裂
(DSB)
的形成和修复程序来完成，此过程涉及
PARP
酶和
CHD1L
分子的参与
。
基于
CHD1L
在
B
细胞的表达在免疫细胞中排名靠前，且
B
淋巴细胞活化时细胞内发生高频的
DSB
与修复，同时考虑到
CHD1L
专有的
macrodomain
结构域，其独特的通过识别
PAR
的形式进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
CHD1L flox/flox
小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
构建同源重组载体；
(2)
将
Cas9 mRNA、gRNA
和同源重组载体通过显微注射至
C57BL/6J
小鼠受精卵中，将受精卵移植至假孕母鼠并产出获得
F0
代子鼠；
(3)
将
F0
代小鼠与正常野生型的
C57BL/6J
小鼠交配繁育获得杂合子
F1
代小鼠；
(4)
将杂合子
F1
代小鼠进行交配繁育得
F2
代小鼠，即所述
CHD1L flox/flox
小鼠
。2.
根据权利要求1所述的
CHD1L flox/flox
小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述同源重组载体包括包含
4.0kb
的
5'
同源臂
、SA
‑
IRES
‑
EGFP
‑
pA、0.7kb
的
flox
区段和
3.6kb
的
3'
同源臂
。3.
根据权利要求1所述的
CHD1L flox/flox
小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述
gRNA
的靶位点位于
CHD1L
基因的第二个外显子的两侧，靶位点
gRNA1
和
gRNA2
的序列如下：
gRNA1
：
5'
‑
ATACCCCTTATGATGAAGTGTGG
‑
3'gRNA2
：
5'
‑
ATTAGAGCAGCCAATGATCCTGG
‑
3'。4.
根据权利要求1所述的
CHD1L flox/flox
小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括对所述
F0
代小鼠和杂合子
F1
代小鼠进行基因型鉴定；所述基因型鉴定的
PCR
引物为：5’
同源重组臂引物序列如下：
F
：
AGTTTGTCCTGTCCTGTGCCTCTT
；
R
：
GCCACTCCCACTGTCCTTTCCT
；3’
同源重组臂引物序列如下：
F
：
GCGGCGTTCTCTCTATTCCA
；
R
：
TCTCCAGGTTGCCTTTGGTC。5.
根据权利要求1所述的
CHD1L flox/flox
小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括对所述
F2
代小鼠进行基因型鉴定；所述基因型鉴定的
PCR
引物为：
P1
：
GCAAACCAGTTCTGTAAACCACATP2
：
GGCAGCCTCACCTCCCATP3
：
GGTTGTGGGTTGTGGCAAGCTTP4
：
TCGCCAAAGGAATGCAAGGTC。6.
采用权利要求1～5任一项所述的
CHD1L flox/flox
...

【专利技术属性】
技术研发人员：马宁芳，曾军，黄丽，赖俊达，黄玥，霍永良，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：