一种小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法技术

一种小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法，它涉及植物细胞工程领域，本发明专利技术通过优化酶解液组合

【技术实现步骤摘要】
一种小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法


[0001]本专利技术属于植物细胞工程领域，具体涉及一种小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法
。

技术介绍

[0002]原生质体是指通过机械或化学的方法去除细胞壁后被质膜包裹的裸露的单细胞，具有细胞全能性
。
原生质体作为遗传转化的重要材料，已被广泛应用于亚细胞定位
、
基因表达分析以及目前新兴的单细胞测序技术等
。
[0003]小黑杨
(Populus simonii
×
P.nigra)
属于杨柳科
(Salicaceae)
，杨属
(Populus Linn.)
，是小叶杨与欧洲黑杨的杂种，
1959
年中国林科院培育成功
。1969
年在黑龙江嫩江地区推广，
1976
年普及全省，至今仍是黑龙江省主要的造林树种
。
黄河流域及其以北的广大地区均有栽植
。
小黑杨生长快，适应性强，抗寒，抗旱，耐瘠薄，轻度耐盐碱
。
材质细密，白色，可供造纸
、
民用建筑等用，是平原地区绿化和造林树种
。
该品种的遗传改良，对于我国林木种质创新，解决林木种质“卡脖子”问题，具有重要意义
。
目前，人们普遍利用农杆菌介导的叶盘法对小黑杨进行遗传转化，但是转化效率极低；因此，建立小黑杨原生质体遗传转化体系，利用小黑杨原生质体初步
、
快速验证基因功能，培养转化后小黑杨原生质体再生植株，对于小黑杨遗传改良具有重要意义
。
[0004]专利公开号
CN102373235A
，专利技术名称
《
一种将外源基因转入杨树原生质体进行瞬时表达的方法
》
，公开了利用
PEG
‑
Ca
2+
将含有外源基因的瞬时表达载体转入杨树原生质体中，经培养，使外源基因在原生质体中表达
。
本专利技术方法构建得到杨树原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，为开展杨树功能基因研究开辟广阔天地，该方法的转化效率可达
70
％
。
该专利采用小于
10kbp
的过量表达载体质粒进行转化，以提高转化效率
。
并不涉及到较大质粒转化
。
该专利没有涉及到小黑杨的原生质体转化
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法，本专利技术的方法能够实现小黑杨原生质体的成功转化，并提高较大质粒条件下的小黑杨原生质体的产量和活力
。
本专利技术的小黑杨叶肉原生质体制备及转化方法，是本专利技术的首创，并没有相关的报道
。
本专利技术的方法得到的小黑杨原生质体产量和活力均能达到较高水平
。
本专利技术的方法能够转化的质粒载体大于
14kbp。
[0006]本专利技术的一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，它包括以下步骤：
[0007](1)
取小黑杨组培苗的幼嫩叶片，吸干叶片表面水分，将叶片切成细条；
[0008](2)
将叶片细条远轴面朝下置于酶解液中分散开；
[0009](3)
将装有酶解液的培养皿密封，在恒温摇床中避光摇动酶解促进原生质体释放；
[0010](4)
用筛网过滤去除未酶解的叶片组织，离心去除酶解液，混匀沉淀，加入与剩余溶液等体积的
W5
溶液，洗涤原生质体两次后冰上静置
30min
；
[0011](5)
加入
MMG
溶液洗涤原生质体一次，离心收集原生质体沉淀，用
MMG
溶液重悬混匀；即得小黑杨叶肉原生质体
。
[0012]进一步地，步骤
(1)
中所选取的小黑杨叶片为组培苗顶端第2～4片真叶；细条宽度为
0.5
～
1mm。
[0013]本专利技术选择组培苗顶端第2～4片真叶同时满足幼嫩且充分伸展开的条件，老叶的细胞壁很难酶解释放原生质体
。
[0014]本专利技术直接取材于小黑杨组培苗顶端幼嫩叶片进行原生质体制备，操作将不受时间限制
。
同时采用
PEG
介导转化法，操作简单，成本低
。
为小黑杨原生质体制备及转化提供多参考
。
[0015]进一步地，步骤
(1)
中叶片切成细条是用刀片去掉叶片主脉后顺着侧脉的方向将叶片切成细条
。
[0016]本专利技术尝试过多种切叶片的方法，针对小黑杨的幼嫩叶片，若用剪刀剪碎得到的细条不均匀，叶片创口太多，得到的原生质体碎片过多；而用刀片切叶片可以更好的控制细条的形状，但是若不沿着侧脉的方向切，小黑杨幼嫩叶片很容易沿着侧脉撕裂开，创面增多细胞碎片也会增多且无法保证切出来的形状均匀，若形状差别很大，则会造成部分细条过度酶解形成碎片，而部分细条酶解不充分原生质体无法完全释放
。
还要注意切的细条不要过细，不同于
CN102373235A
专利技术中要将细条切得尽量的细，本专利技术提出的细条宽度创面最少，可以将破碎细胞量降到最低，得到的原生质体产量和活力都非常高，且均高于
CN102373235A
专利技术中的结果
。
[0017]进一步地，步骤
(2)
中所述酶解液的配制方法为：将1～
2.5
％
w/v
纤维素酶
R
‑
10、0.2
～
0.6
％
w/v
离析酶
R
‑
10
，
0.1
～
0.5
％
w/v
果胶酶
Y
‑
23、0.5
～
0.8M
甘露醇
、pH
值为
5.8
的
20mM MES
和
20mM KCl
混合，在
55℃
水浴
10min
，用快速混匀器涡旋混匀后室温放至，加入
0.1
％
w/v BSA
以及
10mM CaCl2，通过
0.22
μ
m
滤器过滤除菌，即得
。
[0018]本专利技术是通过正交实验设计来优化得到的最佳酶浓度组合，其次本专利技术通过正交实验的极差分析得知，对于小黑杨叶肉原生质体制备来说，离析酶是最主要的因素，而
CN102373235A
专利技术中提到的酶解液组合并无离析酶的成分，并不适用于小黑杨原生质体制备
。
且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)
取小黑杨组培苗的幼嫩叶片，吸干叶片表面水分，将叶片切成细条；
(2)
将叶片细条远轴面朝下置于酶解液中分散开；
(3)
将装有酶解液的培养皿密封，在恒温摇床中避光摇动酶解促进原生质体释放；
(4)
用筛网过滤去除未酶解的叶片组织，离心去除酶解液，混匀沉淀，加入与剩余溶液等体积的
W5
溶液，洗涤原生质体两次后冰上静置
30min
；
(5)
加入
MMG
溶液洗涤原生质体一次，离心收集原生质体沉淀，用
MMG
溶液重悬混匀；即得小黑杨叶肉原生质体
。2.
根据权利要求1所述的一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，其特征在于步骤
(1)
中所选取的小黑杨叶片为组培苗顶端第2～4片真叶；细条宽度为
0.5
～
1mm。3.
根据权利要求1或2所述的一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，其特征在于步骤
(1)
中叶片切成细条是用刀片去掉叶片主脉后顺着侧脉的方向将叶片切成细条
。4.
根据权利要求1所述的一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，其特征在于步骤
(2)
中所述酶解液的配制方法为：将1～
2.5
％
w/v
纤维素酶
R
‑
10、0.2
～
0.6
％
w/v
离析酶
R
‑
10
，
0.1
～
0.5
％
w/v
果胶酶
Y
‑
23、0.5
～
0.8M
甘露醇
、pH
值为
5.8
的
20mM MES
和
20mM KCl
混合，在
55℃
水浴
10min
，用快速混匀器涡旋混匀后室温放至，加入
0.1
％
w/v BSA
以及
10mM CaCl2，通过
0.22
μ
m
滤器过滤除菌，即得
。5.
根据权利要求1所述的一种小黑杨叶肉原生质体制备方法，其特征在于步骤
(3)
中所述酶解条件为
25
～
28℃
，
80...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，杨萍，孙鑫，孙尧，李瑶，吴琼，黄国庆，薛佳莹，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院高技术研究院，
类型：发明
国别省市：