抑制制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向微管蛋白

【技术实现步骤摘要】
抑制TUBB2基因表达的干扰RNA及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学与生物医药
，具体涉及一种有效抑制
TUBB2
表达的干扰
RNA
，特别是
siRNA
，及其应用
。

技术介绍

[0002]微管蛋白是构成真核细胞骨架的重要部分，广泛存在于活细胞的微管中
。
微管是组成真核细胞骨架的基本元素，主要由微管蛋白
α
和
β
聚合而成
。
在正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡
。
微管在细胞支持和细胞运动中起着至关重要的作用，可以帮助细胞抵抗压缩力，使其能够保持其预期的形状和结构；此外，微管对于细胞运动
、
有丝分裂期间的染色体分离以及细胞器的细胞内运输等过程同样至关重要
。
[0003]在人类中，微管蛋白有五个亚组：
α
‑
微管蛋白
、
β
‑
微管蛋白
、
γ
‑
微管蛋白
、
δ
和
ε
‑
微管蛋白以及
ζ
‑
微管蛋白
。
β
‑
微管蛋白特别令人感兴趣，因为它形成了一种仅在神经元中表达的微管
。
此外，所有与人微管蛋白结合的药物也与
β
‑
微管蛋白结合，使其成为一种治疗靶点/>。
[0004]抗有丝分裂化疗药物以微管蛋白为靶点，微管蛋白是有丝分裂纺锤体中的主要蛋白质，微管蛋白亚型组成被认为是肿瘤进展诊断和细胞对化疗反应的决定因素
。
这意味着正常组织和肿瘤组织的亚型组成是不同的，为肿瘤的化疗药物的开发提供了理论基础
。
目前常见的抗微管蛋白药物有长春碱
、
紫杉醇等
。
其中，紫杉醇可使微管与微管蛋白二聚体之间失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合，防止解聚，稳定微管
。
长春碱主要抑制微管蛋白的聚合，而妨碍纺锤体微管的形成，使核分裂停止于中期；也可引起核崩溃，呈空泡式固缩；作用于细胞膜，干扰细胞膜对氨基酸的运转，使蛋白质的合成受抑制；可通过抑制
RNA
聚合酶的活力而抑制
RNA
的合成，将细胞杀灭于
G1
期
。
这些作用导致细胞在进行有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用
。
因此，通过抑制或促进微管蛋白聚合，干扰微管的平衡，从而影响细胞的有丝分裂，抑制细胞增殖
。
[0005]β2微管蛋白存在于细胞核，也可以非微管形式存在，可以显著影响细胞的行为
。
β2微管蛋白参与了几种类型肿瘤的发生发展，如神经上皮瘤和脑肿瘤
、
结肠癌和前列腺癌
。
在侵袭性转移瘤中，发现了位于细胞核的
β2微管蛋白，暗示其可以与抗微管药紫杉醇和长春碱相互作用
。
细胞质中没有被装配到微管中的
β2微管蛋白可以与电压依赖性阴离子通道
(VDAC)
相互作用，为肌肉细胞提供能量
。
研究发现，
β2微管蛋白的过表达与结肠直肠癌患者较短的预期寿命相关
。
β2微管蛋白定位于细胞核的肿瘤患者的预期寿命甚至更短
。
[0006]因此，本申请筛选出抑制活性较高的干扰
RNA
序列，有望制备成
RNA
药物，用于治疗肿瘤
。
另外，
siRNA
分子较大，带有大量负电荷，很难通过同样带负电荷的细胞膜
。
因此寻找合适的递送系统是开发
siRNA
药物过程中重要的一部分，本申请提供了脂质纳米颗粒
(lipid nanoparticles
，
LNP)
和抗体偶联
siRNA(Antibody
–
siRNA conjugates
，
ARC)
两种可行的递送方式
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种靶向微管蛋白
β
2(TUBB2)
基因的干扰
RNA。
[0008]所述的干扰
RNA
抑制
TUBB2
的表达
。
[0009]所述干扰
RNA
的靶位点序列包含
SEQ ID NO
：1‑
13
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列
。
优选的，所述干扰
RNA
的靶位点序列如
SEQ ID NO
：1‑
13
中的任一个核苷酸序列所示
。
[0010]优选的，所述干扰
RNA
的靶位点序列包含
SEQ ID NO
：1‑
10
或
12
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列
。
优选的，所述干扰
RNA
的靶位点序列如
SEQ ID NO
：1‑
10
或
12
中的任一个核苷酸序列所示
。
[0011]进一步优选的，所述干扰
RNA
的靶位点序列包含
SEQ ID NO
：1‑3或5‑6或8‑
10
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列
。
优选的，所述干扰
RNA
的靶位点序列如
SEQ ID NO
：1‑3或5‑6或8‑
10
中的任一个核苷酸序列所示
。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述干扰
RNA
的靶位点序列包含
SEQ ID NO
：
2、8
和
/
或
10。
所述的干扰
RNA
包含
siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA
或
miRNA
中一种或两种以上的组合
。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的干扰
RNA
为
siRNA。
[0014]所述干扰
RNA
的长度为
17
‑
25nt
，优选
19
‑
21nt
，例如
17、18、19、20、21、22、23、24、25nt。
[0015]所述干扰
RNA
还包括悬挂碱基，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种靶向
TUBB2
基因的干扰
RNA
，其特征在于，所述干扰
RNA
的靶位点序列包含
SEQ ID NO
：1‑
13
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列
。2.
根据权利要求1所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述的干扰
RNA
包含
siRNA、dsRNA、shRNA、aiRNA
或
miRNA
中一种或两种以上的组合；优选的，所述的干扰
RNA
为
siRNA。3.
根据权利要求1或2所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述干扰
RNA
还包括悬挂碱基；优选的，所述的干扰
RNA
包含1‑
10
个悬挂碱基
。4.
根据权利要求3所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述的悬挂碱基位于所述的干扰
RNA
的正义链和
/
或反义链的3’
末端
。5.
根据权利要求3或4所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述的悬挂碱基为脱氧核苷；优选的，所述的悬挂碱基为
dTdT、dTdC
或
dUdU。6.
根据权利要求1‑5任一所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述的干扰
RNA
包含正义链和
/
或反义链；优选的，所述的正义链包含
SEQ ID NO
：
14
‑
26
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列；优选的，所述的反义链包含
SEQ ID NO
：
27
‑
39
中的任一个或两个以上所示的核苷酸序列
。7.
根据权利要求1‑6任一所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述干扰
RNA
还包括至少一种修饰；所述的修饰包括在碱基
、
糖环和
/
或磷酸骨架上进行的修饰；优选的，碱基的修饰包括但不限于5位嘧啶修饰
、8
位嘌呤修饰
、
假尿嘧啶修饰和
/
或5‑
溴尿嘧啶取代；优选的，所述的糖环的修饰包括但不限于
2'
‑
OH
被
H、OZ、Z、halo、SH、SZ、NH2、NHZ、NZ2或
CN
基团取代，其中
Z
为烷基基团；优选的，所述的磷酸骨架修饰包括但不限于硫代磷酸修饰
。8.
根据权利要求7所述的干扰
RNA
，其特征在于，所述的修饰还包括具有肌苷
、
辫苷
、
黄嘌呤
、2'
‑
甲基核糖
、
非天然磷酸二酯键
(
如甲基膦酸酯
、
硫代膦酸酯
)
和
/
或肽的核苷酸
。9.
一种权利要求1‑8任一所述的干扰
RNA
的递送系统，其特征在于，所述的递送系统包含权利要求1‑8任一所述的干扰
RNA
和载体
。10.
根据权利要求9所述的递送系统，其特征在于，所述的载体为病毒载体或非病毒载体；优选的，所述病毒载体包括：慢病毒载体
、
逆转录病毒载体
、
腺病毒载体
、
腺相关病毒载体
、
痘病毒载体或疱疹病毒载体中的一种或两种及以上的组合；优选的，所述非病毒载体包括：脂质体
、
脂质纳米颗粒
、
聚合物
、
多肽
、
抗体
、
适配体或
N
‑
乙酰半乳糖胺
(GalNAc)
中任一种或两种及以上的组合
。11.
根据权利要求
10
所述的递送系统，其特征在于，所述脂质纳米颗粒
/
脂质体包括：阳离子脂质
、
中性脂质
、
聚乙二醇脂质
、
甾族脂质或阴离子脂质中的一种或两种以上组合
。12.
根据权利要求
11
所述的递送系统，其特征在于，所述阳离子脂质包括：十八酰胺
(SA)、
溴化月桂基三甲基铵
、
溴化十六烷基三甲基铵
、
溴化肉豆蔻基三甲基铵
、
溴化二甲基二
‑
十八铵
(DDAB)、[(4
‑
羟基丁基
)
氮杂二烷基
]
双
(
己烷
‑6，1‑
二基
)
双
(2
‑
己基癸酸酯
)
(ALC
‑
0315)、1,2
‑
二油酰基氧基
‑3‑
(
三甲基铵基
)
丙烷
(DOTAP)、1,2
‑
二
‑
(9Z
‑
十八烯酰基
)
‑3‑
三甲基铵
‑
丙烷和
1,2
‑
二
‑
十六酰基
‑3‑
三甲基铵
‑
丙烷
、3
β
‑
[N
‑
(N',N'
‑
二甲基氨基乙烷
)
‑
氨基甲酰基
]
胆固醇
(DC
胆固醇
)、
二甲基二十八烷基铵
(DDA)、1,2
‑
二肉豆蔻酰基
‑3‑
三甲基铵丙烷
(DMTAP)、
二棕榈酰
(C16:0)
三甲基铵丙烷
(DPTAP)、
二硬脂酰基三甲基铵丙烷
(DSTAP)、N
‑
[1
‑
(2,3
‑
二烯丙氧基
)
丙基
]
‑
N,N,N
‑
三甲基氯化铵
(DOTMA)、N,N
‑
二油酰基
‑
N,N
‑
二甲基氯化铵
(DODAC)、1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
丙三氧基
‑3‑
乙基磷酸胆碱
(DOEPC)、1,2
‑
二油酰基
‑3‑
二甲基铵丙烷
(DODAP)、1,2
‑
二亚油基氧基
‑3‑
二甲基氨基丙烷
(DLinDMA)、1,2
‑
二
‑
十四酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷
、1,2
‑
二
‑
十六酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷和
1,2
‑
二
‑
十八酰基
‑3‑
二甲基铵
‑
丙烷
、1,2
‑
二油酰基
‑
c
‑
(4'
‑
三甲基铵
)
‑
丁酰基
‑
sn
‑
甘油
(DOTB)、
二
‑
十八酰胺
‑
丙氨酰基精胺
、SAINT
‑
2、
聚阳离子脂质
2,3
‑
二油酰基氧基
‑
N
‑
[2(
精胺
‑
羧酰氨基
)
乙基
]
‑
N,N
‑
二甲基
‑1‑
丙铵三氟乙酸盐
(DOSPA)、
中的一种或两种以上的组合
。13.
根据权利要求
11
所述的递送系统，其特征在于，所述中性脂质包括：
1,2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱
(DSPC)、1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱
(DPPC)、1,2
‑
二油酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
(DOPE)、1,2
‑
二棕榈酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
(DPPE)、1,2
‑
二肉豆蔻酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾宏丽，林美娜，杨脉，陈晓萌，赵宣，
申请(专利权)人：北京键凯科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：