抗体制造技术

本发明专利技术提供了抗体

【技术实现步骤摘要】
抗体SEA33、融合蛋白SEA33
‑
vHRP、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于食品检测
，涉及肠毒素
A
免疫学检测，具体涉及抗体
SEA33、
融合蛋白
SEA33
‑
vHRP、
制备方法及应用
。

技术介绍

[0002]肠毒素是金黄色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus
）在整个对数期生长期间或从指数期到稳定期合成的一种强效胃肠道外毒素，它们具有超抗原活性，并且对热处理
、
低
pH
和蛋白水解酶具有很强的抵抗力，这使得它们能够在受污染的食物中保持活性并引发食物中毒
。
研究表明，在肠毒素和类肠毒素中，其中约
80
％的金葡菌食物中毒事件与肠毒素
A
有关，
100
～
200 ng
的肠毒素
A
即可诱发葡萄球菌食物中毒
。
尽管金黄色葡萄球菌很容易被通过加热烹饪而被灭活菌体，但由于金黄色葡萄球菌肠毒素
A
（
Staphylococcal entemtoxin A
，
SEA
）具有耐热特性，加热后并不会失去毒性和超抗原活性，因此针对金黄色葡萄球菌肠毒素
A
的检测对于食品安全而言至关重要
。
[0003]申请公布号为
CN113185610A
的中国专利公开了一种金黄色葡萄球菌肠毒素
A
纳米抗体，该专利中给出了基于该抗体的酶联免疫吸附分析方法，虽然该方法能够检测到
SEA
，但是该方法需要进行二抗孵育，操作复杂，检测耗时较长
。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于，提供抗体
SEA33、
融合蛋白
SEA33
‑
vHRP、
制备方法及应用，解决现有技术中的肠毒素
A
免疫学检测的检测耗时较长的技术问题
。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案予以实现：一种融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
，该融合蛋白包括
IgG
抗体信号肽
、
血凝素标签
、
抗体
SEA33、
连接肽
、
辣根过氧化物酶和组氨酸标签
。
[0006]本专利技术还具有如下技术特征：所述的融合蛋白的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的
sequence ID number 7 所示
。
[0007]本专利技术还保护一种如上所述的融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
的制备方法，该方法具体包括如下过程：将抗体
SEA33
的基因片段连接至表达载体
pCMV
‑
N1
‑
HRP
上，然后将重组载体转化至大肠杆菌中，培养后挑选单菌落进行测序，选择测序结果的克隆进行培养并提取质粒，然后转染至哺乳动物细胞中，培养后收集细胞培养液，该细胞培养液中含有融合蛋白
SEA33
‑
vHRP。
[0008]具体的，所述的表达载体
pCMV
‑
N1
‑
HRP
的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的
sequence ID number 9
所示
。
[0009]本专利技术还保护如上所述的融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
用于检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素
A
的应用
。
[0010]如上所述的应用，具体且可选的，采用酶联免疫法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素
A。
[0011]如上所述的应用，具体且可选的，采用蛋白免疫印记法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素
A。
本专利技术还保护一种如上所述的抗体
SEA33
，该抗体的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的
sequence ID number 1 所示
。
[0012]本专利技术还保护一种如上所述的抗体
SEA33
的制备方法，该方法具体包括如下过程：步骤一，骆驼源淋巴细胞
RNA
的获取
。
[0013]步骤二，
VHH
基因片段的扩增：步骤
2.1
，进行反转录
PCR
：以步骤一获取的骆驼源淋巴细胞
RNA
作为模板，进行反转录
PCR
合成
cDNA。
[0014]步骤
2.2
，进行巢式
PCR
的第一轮
PCR
扩增：以步骤
2.1
中反转录合成的
cDNA
作为模板，采用引物
CALL001
和引物
CALL002
，进行第一轮
PCR
扩增，鉴定并回收
PCR
产物
。
[0015]所述的引物
CALL001
的序列为：5’‑
gtcctggctgctcttctacaagg
‑3’
。
[0016]所述的引物
CALL002
的序列为：5’‑
ggtacgtgctgttgaactgttcc
ꢀ‑3’
。
[0017]步骤
2.3
，进行巢式
PCR
的第二轮
PCR
扩增：以步骤
2.2
中的回收到的
PCR
产物作为模板，采用引物
VHH
‑
FOR
和引物
VHH
‑
REV
，进行第二轮
PCR
扩增，鉴定并回收
PCR
产物，该
PCR
产物即为
VHH
基因片段
。
[0018]所述的引物
VHH
‑
FOR
的序列为：5’‑
caggtgcagctgcaggagtctgggggagr
‑3’
。
[0019]所述的引物
VHH
‑
REV
的序列为：5’‑
ctagtgcggccgctgaggagacggtgacctgggt
‑3’
。
[0020]步骤三，纳米抗体文库的构建和鉴定：将噬菌体展示载体以及步骤
2.3
获得的
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
，其特征在于，该融合蛋白包括
IgG
抗体信号肽
、
血凝素标签
、
抗体
SEA33、
连接肽
、
辣根过氧化物酶和组氨酸标签
。2.
如权利要求1所述的融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
，其特征在于，所述的融合蛋白的核苷酸序列如下所示：5’‑
atggagaccgacaccttactgctgtgggtgctgctgttatgggtgcccggtagcaccggcgactacccatacgatgttccagattacgctctgcaggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtacagcctctggattcggttttggtgcgtctgacatgggctggtaccgccaggctccagggaatgagtgcgagttggtctcggctattagcagtgaacgcagcacatactatgcagataacgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgccaagaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtgtattactgtgcggcagggcccctgactacagcgactatttgtgagggtcccgccggtgtctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgccagtagtagtggcagtggtatgcagctgacccccacattctacgataactcttgtcccaacgtgtccaacatcgttcgtgacatcatcgtgaatgagctgaggagcgaccctaggatcgccgccagcattctgaggctgcacttccacgactgcttcgtgaatggctgcgacgcctccattttactggataacaccaccagctttcgtaccgaaaaggacgctttcggcaacgccaacagcgctcgtggcttcagcgtgatcgatcgtatgaaagccgccgtggaaagcgcttgtcccggcacagtgtcttgtgccgatttattaaccattgccgcccagcagtccgtgacactggccggcggacctagctggagagtgcctctgggtcgtagggattctttacaagcctttttagatttagccaacgccaatttacccgcccctttcttcactttacctcagctcaaggacagcttcagaaacgtgggtttaaataggagcagcgatttagtggctttatccggcggccacacatttggcaagagccagtgtcgtttcattatggatcgtctgtacaatttcagcaacaccggtttacccgaccccacactgaacaccacctatctccagactttaagaggtttatgccctttaaacggcaatctgtccgctttagtggatttcgacttacgtacccccacaatcttcgacaacaaatactacgtgaatttagaggagcagaagggtttaatccagagcgaccaagaactgttttccagccccgatgccaccgacaccatccctctggtgaggagcttcgccaactccacccagaccttcttcaacgcctttgtggaggccatggatcgtatgggcaacattacccctctgaccggcacccaaggtcagattcgtaggaactgtagggtggtgaatagcaacagcgatttacatcatcaccaccatcaccactaa
‑3’
。3.
一种如权利要求1所述的融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下过程：将抗体
SEA33
的基因片段连接至表达载体
pCMV
‑
N1
‑
HRP
上，然后将重组载体转化至大肠杆菌中，培养后挑选单菌落进行测序，选择测序结果的克隆进行培养并提取质粒，然后转染至哺乳动物细胞中，培养后收集细胞培养液，该细胞培养液中含有融合蛋白
SEA33
‑
vHRP
；所述的表达载体
pCMV
‑
N1
‑
HRP
的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的
sequence ID numb...

【专利技术属性】
技术研发人员：王新，张瑶，张鹏飞，万阳丽，常冠红，周婷，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：