一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法技术

本申请提供了一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，包括将

【技术实现步骤摘要】
一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法


[0001]本申请属于基因检测定量
，具体涉及一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法
。

技术介绍

[0002]高通量测序文库（
NGS
文库）制备的目的是，在片段化后的待测核酸片段上连接特异性的接头序列，让它们能够在高通量测序平台上进行测序
。NGS
文库的质量对于高通量测序（
NGS
）产出的数据质量至关重要
。
过低估计文库的大小，容易导致多重模板太多，数据质量不高；过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或高估文库的量都会影响测序质量与效果
。
因此，
NGS
文库在上机测序之前，需要对其浓度进行精准测定，以便上机测序时能够调整得到合适的上机测序浓度，最终获得最优的测序数据结果
。
[0003]传统的高通量测序流程中使用多种文库定量方法，例如
qPCR
定量法
、
分光光度计（如
NanoDrop
）
、
荧光染料法（
Qubit
）或电泳（
Bioanalyzer
），广泛采用的是
Qubit
®
荧光定量方法和
qPCR
定量方法
。
[0004]Qubit
®
荧光定量方法是利用
Qubit
®
荧光定量仪，以及配套的
Qubit
试剂，其原理为特定荧光染料选择性地特异性靶分子结合，发射荧光信号，随后被定量仪检测
。
双链
DNA
定量的具体做法为，首先将
Qubit dsDNA
检测试剂盒中浓缩的检测试剂和稀释缓冲液按照
1:199
的比例配置混合液，随后取
DNA
文库2μ
L
，加入到
198
μ
L
混合液中，震荡混匀，上机定量
。
然而该方法具有选择局限性，
Qubit dsDNA
检测试剂对双链
DNA
（
dsDNA
）具有高度选择性
。
待检测样本在提取建库的过程中，难免会有一些特殊的处理方式来达到自己的实验目的
。
然而该处理方式极有可能会导致建出的
DNA
文库存在特殊结构，该特殊结构会严重影响
Qubit dsDNA
对二代测序文库的准确定量，在实践过程中，经常会发生根据
qubit
定量进行浓度测定后，上机测序，最终获得的测序数据质量参差不齐，均一性变差
。
并且标本的上样量受限制
。
[0005]NGS
文库
QPCR
法定量检测，是使用特异性引物仅扩增样品中两端接头连接完整的文库分子，即可以进行测序的文库，可排除单端或双端都不连接接头的不可测序文库的干扰，避免非特异性检测，测定值与真实值最接近，并且检测灵敏度最高，非常适合低浓度文库（
PCR
‑
free
文库）的检测，因此，
qPCR
是
DNA
文库定量的金标准，是目前行业内进行文库定量的首选方法
。
其定量检测的基本原理是，将检测待测
NGS
文库的检测结果，与标准品制备的标准曲线进行比较，通过标准曲线进行相对定量，然后再根据待测
NGS
文库的片段与标准品片段的大小差异进行定量结果的校正
。
理论上，现有的
NGS
文库染料法
QPCR
定量检测，能够比较准确的定量
NGS
文库，混样比例均一
、
稳定，为上机测序提供准确的浓度信息
。
但是
qPCR
定量却延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性降低，而且
qPCR
对人员操作的稳定性
、
熟练性要求过高，容易出现人为失误
。
[0006]基于以上两种定量方法学的缺陷，我们将两种方法通过公式及实验经验值进行了优化，提出了本专利技术
。

技术实现思路

[0007]针对现有文库定量技术中
qPCR
定量虽然比较准确的定量
NGS
文库，混样比例均一
、
稳定
。
但是，延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性降低，而且
qPCR
对人员操作的稳定性
、
熟练性要求过高，容易出现人为失误
。Qubit
定量文库，时间短，操作简单方便，但是特异性较差等问题
。
本申请将两种方法通过公式及实验经验值进行了优化
。
[0008]具体的，本申请提供一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，包括：
[0009]将
PCR
扩增后的文库进行
qubit
上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；
[0010]按照预先设置的稀释倍数换算公式，将
qubit
浓度换算成
qPCR
浓度，进行混样稀释，后进入下一步的模板制备；
[0011]所述换算公式为；
[0012]其中，
DNA
文库浓度为
qubit
测定得到的浓度值，单位为
ng/
μ
L
；
660
（
Da
）为
DNA
一个碱基对的相对分子质量；
pM
为换算成
qPCR
后的浓度值，单位为
pmol/ul。
[0013]作为本申请的进一步说明，所述
qubit
上机定量浓度测定过程具体为：将
PCR
扩增后的文库按照一张芯片的上样标本进行分组，每一组专人取
DNA
文库2μ
L
，加入到
198
μ
L
混合液中，震荡混匀，避光2分钟后，进行
qubit
上机定量浓度测定
。
[0014]作为本申请的进一步说明，所述经验常数取值为
3。
[0015]作为本申请的进一步说明，所述
DNA
文库的平均长度
=DNA
片段长度
+
已知接头长度；根据测序可以得出，所述
DNA
片段长度为
135
，所述已知接头长度为 100
，故所述
DNA
文库的平均长度为
235。
[0016]作为本申请的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种能够减少人为实验误差的测序文库的定量方法，其特征在于，包括：将
PCR
扩增后的文库进行
qubit
上机定量浓度，并记录到相应的操作记录表内；按照预先设置的稀释倍数换算公式，将
qubit
浓度换算成
qPCR
浓度，进行混样稀释，后进入下一步的模板制备；所述换算公式为；其中，
DNA
文库浓度为
qubit
测定得到的浓度值，单位为
ng/
μ
L
；
660
（
Da
）为
DNA
一个碱基对的相对分子质量；
pM
为换算成
qPCR
后的浓度值，单位为
pmol/ul。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述
qubit
上机定量浓度测定过程具体为：将
PCR
扩增后的文库按照一张芯片的上样标本进行分组，每一组专人取
DNA
文库2μ
L
，加入到
198
μ
L
混合液中，震荡混匀，避光2分钟后，进行
qubit
上机定量浓度测定
。3.<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文芳，刑增文，邱小翠，石礼森，韩语，韩燕媚，
申请(专利权)人：海口市妇幼保健院海口市妇女儿童医院，
类型：发明
国别省市：