利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法

【技术实现步骤摘要】
利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法
。

技术介绍

[0002]随着分子生物技术快速发展，特别是转基因技术的出现，给植物育种带来新的技术手段
。
转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此，检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步
。
[0003]目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：比较基因组杂交技术
(comparative genome hybridization,CGH)、TaqMan
荧光探针技术
、
变性高效液相色谱
(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)
技术
、
多重连接探针扩增技术
(multiplex ligation
‑
dependent probe amplification,MLPA)
和新一代测序技术等
。
尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：
CGH
技术分辨率在
Mb
水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时该技术操作繁琐，通量低
、
耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板
DNA
，不利于大范围的推广；
TaqMan
荧光探针合成原料成本高
、
获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差；
DHPLC
技术在实践应用中，分辨力常受到实验设计
、
检测环境等因素的影响，存在可靠性和稳定性欠佳的问题；
MLPA
技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长；新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室
、
基层医院或医学检验所开展
。
[0004]实时荧光定量
PCR
技术
(quantitative real
‑
time PCR
，
qPCR)
是一种在
DNA
扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应
(PCR)
循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定
DNA
序列进行定量分析的方法
。
常规
qPCR
用于拷贝数分析时，需要至少两对引物，一对引物用于扩增目的基因，一对引物用于扩增内参基因
(
一般选取基因组中的单拷贝基因
)
，通过扩增效率和
Ct
值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数
。
该方法最常见的问题有：两对引物扩增效率不一致；每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异；目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中，不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化
。
由于
qPCR
的灵敏度较高，上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远，故常规
qPCR
在鉴定拷贝数时存在较大的误差
。

技术实现思路

[0005]有鉴于
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，具有检测灵敏度高
、
结果准确性高
、
检测效率高及检测成本低等优点
。
[0006]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，以水稻
OsGluB5
基因
3'UTR OsGluB5Ter
为内源序列，在内源
3'UTR
的序列中插入长度大于
10bp
的
DNA
指纹序列，得到转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
；基于所述转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
的序列，在所述
DNA
指纹序列的两侧设计共用引物对；以转基因生物为待测样品；使用所述共用引物对，以待测样品的基因组
DNA
为模板，进行
qPCR
，得到
PCR
产物；分析所述
PCR
产物的熔解曲线，根据转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列熔解峰和内源
3'UTR OsGluB5Ter
序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；所述转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列熔解峰和内源
3'UTR OsGluB5Ter
序列熔解峰对应的温度差值
≥1.2℃。
[0008]转基因生物中含有基因表达盒，所述基因表达盒包括启动子
、
基因编码区和终止子等元件，其中，所述终止子元件来源于植物内源序列
。
本专利技术以水稻
OsGluB5
基因
(LOC_Os02g16820)3'UTR OsGluB5Ter
为内源序列，然后在所述内源
3'UTR
的序列中插入
DNA
指纹序列，得到转基因终止子元件，命名为
OsGluB5Ter
‑
T。
[0009]本专利技术所述转基因生物包含转基因表达盒中的
OsGluB5Ter
‑
T
元件
。
当该表达盒在转基因生物体内正常表达时，该
OsGluB5Ter
‑
T
元件及其对应的
OsGluB5Ter
内源序列在该转基因生物体同时获得表达
。
进而，本专利技术通过向转基因表达盒的终止子元件中插入
DNA
指纹序列的方式，使转基因生物体内通过转基因终止子序列和内源
3'UTR
序列形成的结构差异计算基因的表达量
。
[0010]OsGluB5Ter
‑
T
中插入有
DNA
指纹序列
。
当含有
OsGluB5Ter
‑
T
的基因表达盒在转基因生物体内正常表达时，以该转基因生物的基因组
DNA(
含转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列和内源
3'U本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，其特征在于，以
OsGluB5
基因
3'UTR OsGluB5Ter
为内源序列，在内源
3'UTR
的序列中插入长度大于
10bp
的
DNA
指纹序列，得到转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
；基于所述转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
的序列，在所述
DNA
指纹序列的两侧设计共用引物对；以转基因生物为待测样品；使用所述共用引物对，以待测样品的基因组
DNA
为模板，进行
qPCR
，得到
PCR
产物；分析所述
PCR
产物的熔解曲线，根据转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列熔解峰和内源
3'UTR OsGluB5Ter
序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；所述转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列熔解峰和内源
3'UTR OsGluB5Ter
序列熔解峰对应的温度差值
≥1.2℃。2.
根据权利要求1所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，其特征在于，所述内源
3'UTR OsGluB5Ter
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，和
/
或，所述
DNA
指纹序列如
SEQ ID NO.3
所示
。3.
根据权利要求1或2所述转利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，其特征在于，所述转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。4.
根据权利要求1‑3任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，其特征在于，转基因生物目的基因拷贝数＝
K
×
(
转基因终止子
OsGluB5Ter
‑
T
序列熔解峰荧光值
/
内源3′
UTR OsGluB5Ter
序列熔解峰荧光值
)
，
K
为常数
。5.
根据权利要求1‑4任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法，其特征在于，若样本的
OsGluB5Ter
‑
T
熔解峰缺失，仅存在
OsGluB5Ter
熔解峰，则该样本的
OsGluB5Ter
‑
T
目的基因拷贝数为0；若样本的
OsGluB5Ter
‑
T
熔解峰荧光值
/OsGluB5Ter
熔解峰荧光值在
0.25
‑
0.74
之间，则该样本的
OsGluB5Ter
‑
T
目的基因拷贝数为1；若样本的
OsGluB5Ter
‑
T
熔解峰荧光值
/OsGluB5Ter
熔解峰荧光值在
0.75
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵光苗，欧阳超，安保光，金雄霞，王健华，陈建南，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：