聚合-剪切循环反应与制造技术

本发明专利技术公开了一种聚合

【技术实现步骤摘要】
聚合
‑
剪切循环反应与CHA相结合的miRNAs检测方法与应用


：
[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种采用聚合
‑
剪切循环反应与催化发夹组装
(CHA)
相结合的串联荧光传感系统检测
miRNAs
的方法与应用
。

技术介绍

：
[0002]MicroRNAs(miRNAs)
是真核生物中一类内生的
、
参与基因转录后水平调控的短链非编码小分子
RNA
，长度一般在
19
‑
25
个碱基
。
随着对
miRNAs
探索的逐渐深入，研究发现
miRNAs
与肿瘤的关系十分密切，它广泛参与肿瘤的生长
、
分化
、
调亡
、
侵袭及转移等多个生物学过程，现已成为一种新型的潜在肿瘤诊断标志物
。
[0003]目前肿瘤的诊断及预后评价中还存在很多局限，无创的影像学检查无法作为大多数肿瘤的确诊手段
。
肿瘤的确诊主要依赖于活检或手术标本的病理学检查，但是病理学检查的有创性和主观性等局限，使其不适合做大范围的普查
。
临床上虽然也通过血液中的标志物做肿瘤的辅助诊断，如前列腺特殊抗原
(PSA)
辅助诊断前列腺癌，
α
甲胎蛋白
(AFP)
辅助诊断肝癌，但这些诊断标志物的特异性和敏感性不强
。
相比较而言，
miRNAs
更适合作为生物标志物，其原因在于：一是很多
miRNAs
在特定组织中的表达具有特异性和时序性，具有诊断
、
治疗指导和预后评估的价值；二是
miRNAs
相对稳定
、
长度短
、
稳定性高，可在恶劣的环境下保持稳定，如煮沸
、
高或低
pH、
长时间保存及冻融等，其在组织
、
体液及分泌物中也能稳定存在，如血液
、
尿液
、
唾液甚至粪便
。
[0004]miRNAs
的检测技术主要包括
Northern
印迹技术
、
实时荧光定量
PCR(Qrt
‑
PCR)、
微阵列技术等
。
这些方法的构建，极大地丰富了
miRNAs
临床诊断的手段，具有重要的参考意义
。
然而，这些技术都存在一些不可避免的缺陷，如
Northern
印迹技术的操作步骤繁琐，且耗时长，难以满足临床快速
、
实时诊断的需求；
qRT
‑
PCR
技术是目前在临床应用较为广泛的技术手段，需要依赖昂贵的仪器设备和专业的技术人员进行操作，不利于该技术广泛的普及和应用；微阵列技术存在灵敏度较低
、
检测的特异性欠佳的问题
。
同时，
miRNAs
同源性高
、
长度短以及表达丰度低等特点，使得检测难度极大
。
以上的问题都极大地限制了现有技术手段在临床的应用
。
[0005]随着分子医学的发展，核酸探针在分子诊断方面的优势逐渐受到人们的关注，但是这些探针在用于临床样本检测时，还存在一些局限性，如部分核酸探针功能单一，为完成检测系统的构建，需要引物的介入，使得整个检测系统操作变得复杂，不利于复杂环境中的检测；此外，为减少复杂性，往往会将部分引物进行删减或组装到探针上，在避免了复杂性的基础上，又可能导致扩增效率受限，使增敏效果欠佳，同样无法满足临床的需求
。
因此，优化核酸探针设计，构建简便性强
、
灵敏度高
、
特异性好的
miRNAs
检测平台，满足临床检测的实际需求，仍然是个巨大的挑战
。

技术实现思路

：
[0006]聚合
‑
剪切循环反应作为经典的核酸扩增反应，其主要特点是在一段固定的单链
DNA
模板上，以核酸内切酶识别位点为起始点，可以大量的生产有序的
DNA
片段
。
催化发夹组装反应是一种基于立足点链置换反应的无酶循环反应，依赖于特定的引物为催化剂，来催化处于亚稳态的两个发夹探针形成稳定的
DNA
双链的过程
。
本专利技术首次将两种不同的核酸扩增理论进行了组合，通过串联的方式形成了紧密的扩增循环系统，从而实现对
miRNAs
的超灵敏检测
。
该检测系统不但检测灵敏度高，而且检测速度快
、
成本低
。
到目前为止，尚未有将聚合剪切反应与催化发夹组装相结合用于
miRNAs
检测的相关报道
。
[0007]本专利技术首先利用
P1
探针特异性地结合待测
miRNAs
；在聚合酶和核酸内切酶作用下，以
miRNAs
为引物
、P1
探针为模板发生聚合反应；在聚合反应发生的同时，由于
P1
探针上设计了核酸内切酶的半识别位点，当
miRNAs
延伸到识别位点时，将核酸内切酶的半识别位点补充完整而激活核酸内切酶的活性，进而发生聚合
‑
剪切循环，产生大量的
DDF
序列；随后向体系中加入
P2
探针和
P3
探针，
DDF
可以与
P2
探针发生碱基互补配对，进而将
P2
探针发夹打开，从而激活
P2
探针与
P3
探针之间的催化发夹组装，产生稳定的
DNA
双链；将上述反应液直接进行荧光测定，根据获得的荧光数值即可实现对
miRNAs
的检测
。
[0008]本专利技术的目的之一在于提供一种采用聚合
‑
剪切循环反应与催化发夹组装相结合的串联荧光传感系统定量检测
miRNAs
的方法，包括如下步骤：
[0009](1)
将待测血样进行离心，取上清液作为待测溶液；
[0010](2)
将待测溶液与
P1
探针
、
缓冲液
、
聚合酶
、
核酸内切酶以及
dNTPs
充分混合后进行反应，得到含有
DDF
序列的反应液
A
；
[0011](3)
向反应液
A
中加入<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种采用聚合
‑
剪切循环反应与催化发夹组装相结合的串联荧光传感系统定量检测
miRNAs
的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
将待测血样进行离心，取上清液作为待测溶液；
(2)
将待测溶液与
P1
探针
、
缓冲液
、
聚合酶
、
核酸内切酶以及
dNTPs
充分混合后进行反应，得到含有
DDF
序列的反应液
A
；
(3)
向反应液
A
中加入
P2
探针和
P3
探针，充分混合后进行反应，得到反应液
B
；
(4)
基于荧光信号值与
miRNAs
浓度之间的线性关系对反应液
B
中含有的
miRNAs
进行定量检测
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为
25
‑
37℃
，时间为
30
‑
60min。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光信号值为波长
512nm
处的荧光峰值
。4.
一种定量检测
miRNAs
的试剂盒，包括试剂
R1
和试剂
R2
，其特征在于：所述试剂
R1
中含有缓冲液
、P1
探针
、
聚合酶
、
核酸内切酶和
dNTPs
，所述试剂
R2
中含有
P2
探针和
P3
探针
。5.
根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红霞，汪毅，孙峰，王子明，王杰，
申请(专利权)人：李红霞，
类型：发明
国别省市：