一种棘胸蛙微卫星ＤＮＡ标记Ⅲ及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种棘胸蛙微卫星ＤＮＡ标记ＩＩＩ，该微卫星ＤＮＡ标记ＩＩＩ的核苷酸序列为ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：５，该微卫星编号为Ｐｓｐ２０。本发明专利技术还同时提供了该棘胸蛙微卫星ＤＮＡ标记ＩＩＩ的用途：用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记技术，具体涉及一种棘胸蛙的DNA分子遗传标记及其用途。技术背景微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星侧翼序列相对保守，根据其侧翼序列设计引物，可用PCR 扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列广泛存在于真核生物基因组中，而且随机分布，具有高度多态性，选择上中性，共显性等特点，是十分有效的遗传标记，被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲缘关系 (Zhou 等，2005，Progress in Natural Science，15 137-142)、用微卫星 DNA 标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN1370834A)、用微卫星DNA标记进行家蚕分子连锁遗传分析的专利申请“家蚕的SSR标记及其应用”(公开号CN 1970792A)。棘胸蛙(Paa spinosa David)，属两栖纲、无尾目、蛙科。棘胸蛙个体大，肉质细嫩洁白，味道鲜美，具有很高的营养价值和药用价值，素有“百蛙之王”的美称。由于人为捕杀和自然环境的恶化，野生棘胸蛙资源遭到严重破坏，开展棘胸蛙人工养殖既有助于保护野生资源，又能满足市场需求。现在，棘胸蛙是我国重要的养殖蛙类之一，但是由于其基础研究薄弱，要实现规模养殖还有许多亟待解决的问题，其中包括需要一套有效的分子标记对其进行遗传关系分析、种质资源调查、标记辅助育种等。专利技术内容本专利技术要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记III，利用这些分子标记能对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记III，该微卫星 DNA标记III的核苷酸序列为SEQ ID NO :5，该微卫星编号为Ι^ρ20。作为本专利技术的棘胸蛙微卫星DNA标记III的改进，棘胸蛙微卫星DNA标记III引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' -3'，Psp20 正向TTGGCTCATCAACTACCC反向AGTCACATAACATACCCCCT。本专利技术还同时提供了棘胸蛙微卫星DNA标记III的用途，其特征是用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查或辅助育种。实现上述专利技术的技术方案包括棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，确定了 8个多态性丰富的微卫星标记I^spie、Pspl7,Pspl8, Pspl9、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。本专利技术旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立棘胸蛙的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。因此，本专利技术提供了 8个棘胸蛙微卫星位点的DNA序列及扩增上述8个棘胸蛙微卫星位点的引物序列和扩增方法，8个棘胸蛙微卫星位点用于棘胸蛙种质资源研究，遗传关系分析，标记辅助选种和标记辅助育种，重复性好，多态性高，是一种可靠有效的分子标记。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是本专利技术涉及的13个棘胸蛙自然种群的structure聚类图(K = 3)。具体实施方式实施例1、棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建依次进行以下步骤1)、用经典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(广西龙胜)基因组DNA。用限制性内切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因组DNA，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物。2)、将碱基互补的寡核苷酸Sau3AI Oligo A :5' -GGCCAGAGACCCCMGCTTCG-3‘和 Oligo B 5' -pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3‘(上海生工合成，HPLC 级纯化，200pmol/ μ 1)各取10 μ 1轻轻蜗旋混勻，在PCR仪上80°C变性10分钟，然后在室温下使寡核普酸链缓慢退火复性约1小时，加入60 μ 1高纯水制备成浓度为25ρπι01/μ 1带有Sau3AI酶切识别位点的接头。3)、将上述步骤1)所得的酶切产物和步骤2)所得的接头用T4DNA连接酶连接，将所得的连接液用维特洁公司的清洁试剂盒纯化，去除盐离子、蛋白和多余的接头片段，溶解于50 μ 1 TE缓冲液中；得连接产物。4)、用生物素标记的寡核苷酸探针(CA)15与步骤幻所得的连接产物DNA片段杂交。具体操作为在总体积100 μ 1杂交液(6 X SSC, 0. 1% SDS)中加入500ng连接产物和 IOOpmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95°C下变性10min，60°C杂交1小时。5)、在步骤 4)所得物中加入 100 μ 1(10 μ g/μ 1)磁珠(Dynabeads Μ480，购自 Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。6)、在磁力架上吸附磁珠，弃上清。磁珠用400 μ 1洗涤缓冲液(6 X SSC, 0. 1 % SDS) 在60°C下洗涤15分钟，然后在室温下分别用2XSSC和IXSSC溶液洗涤两次，并弃上清。7)、在步骤6)所得物中加入50 μ 1无菌水，在90°C下保温10分钟，小心吸取上清， 上清液即为含有(CA)n重复序列的单链DNA片段。以Oligo A为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。25 μ IPCR 反应体系包含大约 IOOng 单链 DNA 片段，20mm Tris-HCI (pH8. 3)， IOOmmKCI, 3mm MgCl2, dNTP # 1000 ym,3pmol Oligo A, 0. 8units Taq polymerase (Shanghaipromega)0PCR循环程序设置为95°C预变性3分钟，接着5个循环包括95°C变性30s，60°C 退火30s，72°C延伸45s，然后进行另外30个循环的92°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 55s，最后于72°C下延伸10分钟。检测PCR产物并使用维特洁公司的纯化试剂盒纯化，产物溶解于30 μ 1 TE缓冲液中。8)、将步骤7)所得的扩增产物纯化后连接到PMD18-T载体上，然后将连接产物转化至大肠杆菌感受细胞，转化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。实施例2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物设计依次进行以下步骤1)、挑取实施例1所得的白色菌落并接种到:3ml LB培养液中，37°C培养过夜，然后提取质粒。2)、以质粒 DNA 为模板，采取三引物法(Gardner 等，1999，Journal of Heredity, 90,301-304)筛选含有(CA)n微卫星序列的阳性克隆。3)、将阳性克隆测序，分析是否含有(CA)n重复序列，以及是否有足够的侧翼序列用于引物设计。4)、根据微卫星重复序列两侧的保守序列，用primer premier5. 0软件设计引物， 引物长度一般在16-22碱基之间，选择扩增的目标片段在150-350bp之间。实施例3、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棘胸蛙微卫星ＤＮＡ标记Ⅲ，其特征是：该微卫星ＤＮＡ标记Ⅲ的核苷酸序列为ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５，该微卫星编号为Ｐｓｐ２０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑荣泉，叶容晖，杨光，成斌，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]