一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，该方法包括：首先利用磁性纳米颗粒捕获待测样品中的单个细胞外囊泡，磁分离，得到磁性纳米颗粒复合体；再利用生物素修饰的凝集素对磁性纳米颗粒复合体中细胞外囊泡上的聚糖进行亲和标记，然后与荧光素修饰的链霉亲和素结合，得到荧光标记的磁性复合物颗粒；最后利用荧光显微镜采集荧光标记的磁性复合物颗粒的图像数据和荧光信号数据，根据单颗荧光标记的磁性复合物颗粒的荧光强度判断细胞外囊泡上的聚糖表达程度

【技术实现步骤摘要】
一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法
。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡
(Extracellular Vesicles
，
EVs)
是由细胞释放的双层膜结构颗粒的统称，根据分泌机制及物理特性大体可分为外泌体
(
直径
30
～
150nm)、
微囊泡
(
直径
100
～
1000nm)
和凋亡小体
(
直径
50
～
5000nm)
等不同亚型
。EVs
具有稳定且无法复制的封闭囊泡状结构，广泛地存在于血液
、
尿液
、
唾液
、
泪液
、
乳汁
、
腹水等多种体液中，能够反映亲源细胞或组织的多重生物信息，在细胞间通讯
、
免疫调节
、
血管新生
、
细胞迁移
、
癌症的发生发展等多种生理病理过程中起重要作用
。
基于这些特性，
EVs
已在疾病诊断
(
如癌症的早期筛查
)、
药物运输
、
炎症调节
、
医疗美容等多个领域展现出广泛的应用前景
。
[0003]EVs
所具有的广泛的生物学功能及临床应用潜力的物质基础主要在于其内含的生物学分子组分
。
相关研究表明
EVs
携带丰富的内容物，如蛋白质
、
脂质
、
核酸
、
代谢小分子等
。
值得注意的是，近来研究揭示，除上述组分，
EVs
上还含有多种结构的糖基化合物，如
O
‑
聚糖
、N
‑
聚糖和糖脂神经节苷脂等，其参与细胞识别
、
病毒感染
、
发育分化
、
免疫应答等多种生物过程
。
此外，研究表明
EVs
聚糖还可以作为癌症液体活检诊断标志物，如美国德克萨斯大学安德森癌症中心
Raghu Kalluri
团队研究表明血浆
EVs
上的蛋白聚糖
Glypican
‑1有潜力作为靶标工具用于胰腺癌的早期诊断和监测；新加坡国立大学邵慧琳团队初步证实了
EV
聚糖在判断胃癌
、
结直肠癌患者预后方面的良好应用前景等
。
然而，要充分挖掘
EVs
聚糖在生理病理过程中的重要作用及临床上的应用潜力，离不开对其进行深度且准确的解析
。
[0004]相关技术中，
EVs
聚糖分析手段多数是从囊泡样品整体层面进行分析，如液相色谱
、
质谱
、
凝集素微阵列
、
酶联免疫吸附测定法，以及新近开发的基于巨磁阻效应的
GMR
磁学分析方法和基于磁性纳米材料聚糖分析方法，采用这些方法所得信息为囊泡群体的平均信号及综合性特征，这造成了很多微弱但重要的
EVs
聚糖信号
(
如不同囊泡个体间的聚糖异质性
)
被掩盖，进而极大的阻碍了
EVs
聚糖的应用
。
如
EVs
聚糖作为一种新型的生物标志物在癌症液体活检中展现出良好的应用前景，但体液中的
EVs
事实上是不同来源
(
包括肿瘤组织
)EVs
群体的高度复杂的混合体，尤其是在癌症早期，人体体液中癌细胞来源的
EVs
丰度较低，因此利用这些方法对
EVs
聚糖进行分析时，癌细胞来源
EVs
聚糖信号被大量其他细胞或组织来源的
EVs
聚糖信号所掩盖，从而无法有效识别出癌源
EVs
信号，使得
EVs
聚糖在癌症早期检测中的应用受到极大限制
。
[0005]基于此，亟需开发一种新型
EVs
聚糖的解析方法，以克服相关
EVs
聚糖分析方法所面临的不足，为
EVs
聚糖在诸如癌症液体活检等多方面的应用提供新的技术支撑
。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一
。
为此，本专利技术提出一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，其相对于整体性分析方法
(
如常规
ELISA
法
)
具有更优异
的检测灵敏度，能够充分显示不同细胞外囊泡个体间的聚糖信号差异性，实现细胞外囊泡个体间的聚糖表达异质性检测，且该方法检测通量高
、
通用性好
。
[0007]本专利技术提供了一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，包括以下步骤：
[0008]步骤
S1、
利用磁性纳米颗粒捕获待测样品中的单个细胞外囊泡，磁分离，得到磁性纳米颗粒复合体；
[0009]步骤
S2、
利用生物素修饰的凝集素对所述磁性纳米颗粒复合体中细胞外囊泡上的聚糖进行亲和标记，然后与荧光素修饰的链霉亲和素结合，得到荧光标记的磁性复合物颗粒；
[0010]步骤
S3、
利用荧光显微镜采集所述荧光标记的磁性复合物颗粒的图像数据和荧光信号数据，根据单颗所述荧光标记的磁性复合物颗粒的荧光强度判断所述细胞外囊泡上的聚糖表达程度
。
[0011]根据本专利技术实施例的分析方法，至少具有如下有益效果：
[0012](1)
本专利技术方法以纳米尺寸的磁性颗粒为操纵媒介，样品的制备
(EV
捕获及荧光标记
)
在离心管中进行即可，操作简便，无需特殊的实验技能；此外，本专利技术方法是以磁性纳米颗粒作为
EV
固定的媒介，只需将样品滴加于盖玻片基底上，依靠磁性纳米颗粒在基底上的黏附将
EV
固定于观察基底上，无需耗时耗力的基底修饰
。
[0013](2)
本专利技术方法可重复性好，样品需求量低，样品操作体积可自由调节；且本专利技术方法是基于纳米尺寸的磁性颗粒进行参照定位，单个拍摄视野中样品颗粒数可高达
10000
以上，具有检测通量高的优点
。
[0014](3)
本专利技术方法检测灵敏性高，检测限显著低于整体性分析方法
(
如传统的
ELISA
法
)
，对
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种单个细胞外囊泡上聚糖的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤
S1、
利用磁性纳米颗粒捕获待测样品中的单个细胞外囊泡，磁分离，得到磁性纳米颗粒复合体；步骤
S2、
利用生物素修饰的凝集素对所述磁性纳米颗粒复合体中细胞外囊泡上的聚糖进行亲和标记，然后与荧光素修饰的链霉亲和素结合，得到荧光标记的磁性复合物颗粒；步骤
S3、
利用荧光显微镜采集所述荧光标记的磁性复合物颗粒的图像数据和荧光信号数据，根据单颗所述荧光标记的磁性复合物颗粒的荧光强度判断所述细胞外囊泡上的聚糖表达程度
。2.
根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤
S1
中，所述捕获待测样品中的单个细胞外囊泡的具体方法包括：将所述磁性纳米颗粒与待测样品混合，其中所述磁性纳米颗粒的颗粒总量为所述待测样品中细胞外囊泡颗粒总量的
10
倍及以上
。3.
根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为磁性内核颗粒和功能性外壳组成的核壳结构
。4.
根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述磁性内核颗粒包括氧化铁；和
/
或，所述功能性外壳包括聚多巴胺
。5.
根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的平均粒径范围为
100
～
300nm。6.
根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤
S1
中，所述待测样品中的细胞外囊泡来源包括细胞或组织分泌
。7.
根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤
S2
中，所述凝集素包括伴刀豆凝集素
A、
小扁豆凝集素
、
豌豆凝集...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨根，闫宇飞，王志刚，
申请(专利权)人：国科温州研究院温州生物材料与工程研究所，
类型：发明
国别省市：