一种三维即时荧光寿命成像方法与装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种三维即时荧光寿命成像方法与装置，该方法通过对激发光进行相位调制或者全息调制，实现一种非典型聚焦光斑，该光斑具有轴向非对称特征，利用该聚焦光斑实现对样品不同层面同时分区扫描，同时对激发的荧光进行离焦矫正相位调制，实现对不同焦面荧光聚焦在同一面阵探测器的探测面上，结合寿命探测仪器，创新性地实现低像差的三维即时扫描荧光寿命成像，即实现对样品单次二维扫描获得三维荧光寿命信息

【技术实现步骤摘要】
一种三维即时荧光寿命成像方法与装置


[0001]本专利技术属于光学工程领域，尤其涉及一种可实施像差矫正的三维即时扫描荧光寿命显微成像的方法和装置
。

技术介绍

[0002]荧光显微镜结合了单分子级灵敏度
、
分子特异性和亚微米级分辨率等优势，在生物细胞成像和纳米材料成像等领域取得了广泛应用
。
荧光寿命成像作为一种关键的技术方法，已经成为获取被测样品的成分
、
环境和相互作用的重要手段
。
与其他荧光显微镜方法相比，荧光寿命成像基于荧光基团从高能态返回基态并发射荧光光子所需的平均时间，具有不受荧光基团浓度
、
杂散光
、
样品不均匀照明等因素影响的优点，能够反映强度成像难以观察到的信息
。
[0003]荧光寿命成像的原理基于荧光基团的特性
。
荧光寿命是指荧光基团从高能态返回基态并发射荧光光子所需的平均时间，时间跨度从皮秒到几百纳秒不等
。
荧光寿命可以十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用即能量转移
。
这些相互作用包括环境
pH
值的分布
、
离子浓度
、
含氧量
、
粘度
、
折射率和动力学变化等
。
通过测量荧光寿命的方法可以为定量监测微环境变化对研究问题的影响提供一个很好的手段
。
[0004]荧光寿命成像在生物医学领域有广泛的应用
。
随着人们对细胞行为及其机理的研究越来越深入，监测培育环境对生物细胞行为的影响的研究被逐渐重视起来
。
荧光寿命成像可以在细胞水平上探测细胞内化学环境的变化，如细胞器内部的
pH
值
、
离子浓度和含氧量等
。
这些信息对于了解细胞代谢
、
功能和进程具有重要意义，对于研究疾病发生机制和药物治疗等方面具有指导作用
。
[0005]在微纳加工领域，光胶性能的好坏也是关乎最终效果的关键因素之一
。
多种光胶性质参量的定量测量对光刻工艺优化和光刻机理的探究有着重要意义
。
荧光寿命成像可以在材料表面或薄膜上测量荧光寿命，从而获得光胶的性质参数，如粘度
、
附着性和稳定性等
。
这些信息对于优化光胶配方
、
提高光胶的工艺性能和可靠性具有重要作用
。
[0006]常用的荧光寿命测量方法包括频域法
、
门控法
、
条纹相机法以及时间相关单光子计数法
。
基于宽场照明的荧光寿命成像以门控法和条纹相机法为主，而基于点照明的荧光寿命成像则以频域法
、
门控法和时间相关单光子计数法为主
。
时间相关单光子计数法是目前测量精度最高的方法
。
该方法利用时间相关单光子计数器
(TCSPC)
记录脉冲激发光激发的单个荧光光子达到探测器的相对时间，并建立一个正比于荧光衰减曲线的光子数
‑
时间分布直方图，然后拟合出荧光寿命曲线
。
因此，在众多测量方法中，时间相关单光子计数法是目前荧光寿命测量最为主要的方法
。
[0007]虽然荧光寿命成像已取得了一定的进展，但过往的荧光寿命成像系统大多集中在二维平面成像上，而在三维体荧光寿命即时成像上进展较少
。
体荧光寿命即时成像对实时研究立体空间上不同层上的各个结构所处的微环境变化有着重要意义
。
例如纳米颗粒凭借其独特的物理化学性能，在生物医学领域具有广泛的应用前景，比如细胞标记
、
疾病诊断
、
药物传输
、
癌症治疗等
。
这些纳米尺度的颗粒在进入生物体系后，由于其较大的比表面积，很容易与其周围的环境发生相互作用，而生物体系内复杂的化学环境会改变这些纳米颗粒的稳定性，比如发生降解
。
因此，对于纳米颗粒的研究，不仅需要了解其表面和内部的化学环境，还需要了解其周围微环境的变化对其稳定性的影响
。
[0008]过往的荧光寿命成像技术只能对单一层进行扫描成像，无法在立体空间上从各个维度的环境的变化对研究对象进行研究
。
在荧光显微镜领域，三维显微成像常用的方法有光片扫描，全内反射层析扫描，机械层切扫描等
。
这些技术手段也是实现三维荧光寿命成像较为常用的手段，例如基于面阵共聚焦实现的三维荧光寿命测量
[CN115200508A]、
基于多探测器分立荧光光谱实现的荧光寿命测量
[CN110274895A]、
基于荧光光谱实现不同结构和成分的荧光寿命测量
[CN115356313A]等都可以实现三维荧光寿命的测量，但其测量方法均采用机械层切扫描实现的，因此这些方法都不能实现对不同层面结构的同时观测
。
[0009]然而，近年来，随着三维成像技术的发展，一些研究者开始尝试将点扩散函数工程应用于荧光寿命成像中，以实现三维体荧光寿命即时成像
。
点扩散函数工程通常通过相位调制来获得轴向非对称结构的点扩散函数，从而改善三维成像的能力
。
例如，利用前沿的相位调制技术，可以在对象平面上实现高分辨率的荧光寿命成像，同时通过徐周期相位提高轴向分辨率
。
通过相似的思路，已有的体成像方法通过
GS
算法进行相位编码在样品面生成4层阵列式聚焦光斑，并相应的通过探测器阵列获取体成像结果
[Simon M.Ameer
‑
Beg,Optics Letters,2018]。
然而，该方法中的探测器阵列无法实现与所有激发平面的共轭，导致所探测的图像出现离焦，影响了成像质量
。
此外，由于没有实现探测光路的点扩散函数的调制，该方法中探测器的尺寸限制了轴向可探测范围，从而导致成像体积较小
。
[0010]总之，荧光寿命成像作为一种重要的生物成像技术，具有许多优势和广泛应用的潜力
。
随着技术的不断创新和改进，发展更高分辨率
、
更精确的三维体荧光寿命即时成像技术也是未来的研究方向，将进一步推动荧光显微镜的发展和应用前景
。
在未来的研究中，可以进一步改进和创新成像技术，以实现更高分辨率
、
更准确的三维体荧光寿命即时成像
。
一种可能的方法是通过利用先进的相位调制技术和探测器阵列的优化，在点扩散函数的调制和检测方面取得突破
。

技术实现思路

[0011]本专利技术旨在解决当前荧光寿命成像在即时三维成像上的离焦和体积受限的问题，提出一种新的方法与装置，通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种三维即时荧光寿命成像方法，其特征在于，包括步骤：
1)
将激光器发出的激发光，将其准直后转换为线偏振激光，使用空间光调制器对激发光进行相位调制或者全息调制，生成轴向非对称聚焦光斑；
2)
调整光路系统，使得空间光调制器调制区域与物镜入瞳位置形成成像共轭关系；
3)
使用四分之一波片将相位调制后的线偏振激发光转为圆偏振激发光，所述的圆偏振激发光在二维扫描振镜系统的调制下投射在待测样品上进行二维扫描，激发荧光；
4)
激发的荧光经过物镜收集后，经过二维扫描振镜系统实施去扫描；
5)
经过去扫描后的荧光被空间光调制器进行离焦矫正相位调制，将不同焦面发射的荧光透过单透镜并聚焦在面阵探测器内，其中空间光调制器对荧光实现两次相位调制，每次调制只调制单一方向偏振，荧光通过折返光路两次经过一片四分之一波片和一片透镜，空间光调制器两次调制的区域形成成像共轭关系，调整四分之一波片的快轴方向，使得荧光偏振方向旋转
90
度；
6)
面阵探测器面阵上不同位置的探测器收集不同焦面的荧光，收集的荧光信号被时间相关单光子计数器记录，获得荧光发射的时间曲线；
7)
收集的荧光时间信号经过电脑寿命分析以及离焦三维反卷积算法，最终获得样品的三维荧光寿命成像结果
。2.
如权利要求1所述的三维即时荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤
1)
中，由于空间光调制器只能对特定角度的线偏振进行调制，将激发光线偏振的偏振方向调整为与空间光调制器调制偏振方向一致
。3.
如权利要求1所述的三维即时荧光寿命成像方法，其特征在于，步骤
2)
所述空间光调制器调制区域与物镜入瞳位置形成成像共轭关系，以满足全息相位调制的条件，即调制区域为样品经过物镜后的傅里叶相位面
。4.
如权利要求1所述的三维即时扫描的体荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤
3)
中，将线偏振激发光转换为圆偏光再对样品进行扫描，使投射到样品上的光斑光强分布更均匀
。5.
如权利要求1所述的三维即时荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤
1)
中，激发光经过空间光调制器相位调制或者全息调制后，在样品面上形成非典型聚焦光斑，该光斑具有轴向非对称特征，包括：螺旋聚焦光斑，离散错位聚焦光斑
。6.
如权利要求1所述的三维即时荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤
5)
中，为了实现荧光全息调制的目的，用于荧光调制的空间光调制器调制区域与聚焦荧光到探测器的聚焦物镜的入瞳形成共轭关系
。7.
如权利要求1所述的三维即时扫荧光寿命成像方法，其特征在于，所述步骤
5)
中，空间光调制器分成两个调制区域分别调制荧光的垂直和水平偏振分量，即
S
偏振和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智敏，匡翠方，朱大钊，黄宇然，刘旭，
申请(专利权)人：之江实验室，
类型：发明
国别省市：