一株产腈水解酶的菌株制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一株产腈水解酶的菌株

【技术实现步骤摘要】
一株产腈水解酶的菌株、发酵方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一株生产腈水解酶的菌株
、
发酵方法及应用
。

技术介绍

[0002]草铵膦，又名2‑
氨基
‑4‑
(
羟基甲基膦酰基
)
丁酸铵，属于有机膦类部分内吸除草剂，通过作用于植物体谷氨酰胺合成酶，抑制
L
‑
谷氨酰胺合成
。
随着转基因农作物技术的高速发展以及世界范围内对转基因抗草铵膦作物的大力推广，市场上草铵膦的使用需求一直保持较高速的增长，同时由于抗草甘膦杂草的不断发生和发展，带来的双草复配技术的推广，给草铵膦带来了更大的市场空间
。
目前国内企业基本都采用
Strecke
法生产草铵膦，2‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈是生产过程中的关键中间体，经强酸或强碱水解后获得草铵膦，伴随有大量盐类形成，为后续的分离纯化带来困难，也造成一定的环境污染
。
腈水解酶
( EC 3.5.5.1)
直接催化2‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈生成草铵膦，反应条件温和
、
成本低
、
有效避免化学酸法水解腈带来的副产物盐，减轻环境压力，是合成草铵膦的有效酶源之一
。

技术实现思路
/>[0003]本专利技术要解决的技术问题在于提供从土壤中分离得到的一株高效生产腈水解酶的菌株，并应用该菌株产生的腈水解酶制备草铵膦的方法
。
本专利技术所提供的产腈水解酶的菌株是从烟台海底淤泥中分离得到，这是一株产腈水解酶活力较高的菌株，培养简单
、
遗传稳定性强，可以直接用于酶法制备草铵膦
。
[0004]本专利技术的技术方案如下：一株产腈水解酶的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为
2023
年9月
19
日，分类命名为白地霉（
Geotrichum candidum
），保藏编号为：
CGMCC No. 28486。
[0005]进一步，该菌株的
18S rRNA
基因序列如
SEQ.NO.1。
[0006]本专利技术还提供所述菌株发酵生产的腈水解酶的方法，发酵温度为
28
～
37℃
，
pH7.0。
[0007]进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度为：甘油 15 g/L
，麦芽浸粉 5g/L
，酵母浸粉 5g/L
，
KH2PO
4 2 g/L
，
MgSO
4 0.2 g/L
，
NaCl 1 g/L
，
CoCl
2 0.1mg/L
，
FeSO
4 2 mg/L
，
MnSO
4 2 mg/L
，泛酸钙
2 mg/L
，叶酸
1mg/L
，维生素
B11mg/L
，腈化合物 0.2g/L
，琼脂 20g/L
，
pH6.0。
[0008]本专利技术还提供所述菌株的应用，所述应用为利用所述菌株发酵产生的全细胞酶以2‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈为底物水解合成
D/L
体草铵膦，水解反应温度为
30
‑
40℃
，水解反应底物浓度为5‑
10g/L
，催化液中菌体细胞与2‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈质量比为
5:1
‑
10:1。
[0009]本专利技术与现有技术相比的有益效果：
1、
本专利技术所提供的白地霉
Ytz23
遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的腈水解酶酶活力高，对部分脂肪腈具有较高的水解活性，工业应用具有优势
。
[0010]2、
白地霉腈水解酶对2‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈无光学选择性，无差别水解合成
D/L
体草铵膦，转化率在
84.8%
以上
。
所述方法避免了传统酸水解工艺带来的大量副产物盐，减轻后处理工艺的除盐压力
。
具体实施方式
[0011]为阐明对本项专利技术特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本专利技术做进一步阐述
。
[0012]下述实施例中对酶活测定：酶反应体系：
pH 7.0、50 mmol/L
磷酸盐缓冲液
2.0 mL、
发酵液
0.1 mL、2
‑
氨基
‑
4(
羟基甲基磷酰基
)
‑
丁腈（
200 g/L
）
0.4 mL
，反应
15min
，按体积比
1∶1
加入
10%
三氯乙酸溶液，
4 ℃
放置终止反应， HPLC
检测草铵膦含量
。
样品采用邻苯二甲醛衍生：手性液相色谱条件为
C18
色谱柱
(250 mm
×
4.6 mm, 10 μ
m)
，柱温
30℃
；检测波长：
338 nm
；流动相：
0.376%
乙酸钠：乙腈（
95:5
，
v/v
）流速：
0.85 mL/min。
手性分析结果用
ee
值表示，
ee
值为
([S]‑
[R]/[S]+[R])*100
％
。
酶活力定义：在
pH 7.0、
温度
37 ℃
的条件下，每毫升发酵液每
l min
转化生成1μ
mol 草铵膦所需的酶量为1个酶活力单位
U。
[0013]实施例1菌株的分离与鉴定（1）菌株分离：样本采集自山东烟台近海岸海底淤泥
。
称取
1g
样本加入装有
100mL
无菌水的摇瓶中摇匀，梯度稀释后涂布于筛选平板上（筛选培养基：甘油 15
，
KH2PO
4 2
，
MgSO
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一株产腈水解酶的菌株，其特征在于，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为
2023
年9月
19
日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为白地霉，保藏编号为：
CGMCC No. 28486。2.
根据权利要求1所述的一株产腈水解酶的菌株，其特征在于，所述菌株的
18S rRNA
基因序列如
SEQ.NO.1
所示
。3.
利用权利要求1所述菌株发酵生产的腈水解酶的方法，其特征在于，发酵温度为
28
～
37℃
，
pH7.0。4.
根据权利要求3所述的发酵生产的腈水解酶的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的成分及终浓度为：甘油 15 g/L
，麦芽浸粉 5g/L
，酵母浸粉 5g/L
，
KH2PO
4 2 g/L
，
MgSO
4 0.2 g/L
，
NaCl 1 g/L
，

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志彬，张怀媛，陶美君，王宇婕，张娟，芮亚楠，许梅，田霏繁，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：