超唾液酸化细胞制造技术

本发明专利技术涉及具有增加的唾液酸化活性的哺乳动物细胞

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超唾液酸化细胞


[0001]本专利技术涉及重组蛋白生产领域
。
提供了具有增加的唾液酸化活性的宿主细胞
。
特别地，将唾液酰基转移酶基因
、
半乳糖基转移酶基因和唾液酸转运体基因引入宿主细胞中，导致重组表达的糖蛋白的超唾液酸化
。
因此，产生了具有非常大量的唾液酸的蛋白质
。

技术介绍

[0002]中国仓鼠卵巢
(CHO)
细胞系是用于产生治疗性蛋白的最广泛使用的哺乳动物细胞系，并且在抗体和其他治疗性蛋白形式中表现出克
/
升范围内的高生产率
。
尤其是重组非抗体治疗性蛋白的表达越来越重要
。
[0003]文献中描述了治疗性蛋白的超唾液酸化导致药物半衰期延长
。
唾液酸化不足
(
近末端半乳糖暴露
)
可能导致蛋白质通过无唾液酸糖蛋白受体介导的途径被更快地清除
(Bork
等人
(2009)Journal of Pharmaceutical Sciences[
药物科学杂志
]98:3499
‑
3508)。
有几个实例说明了超唾液酸化如何改善重要生物药物蛋白的整体治疗功效
(Morell
等人
(1971)JBC[
生物化学杂志
]246(5):1461
‑7；
Richards
等人
(2010)Mol Endocrinol[
分子内分泌学
]24(1):229
‑
39
；
Datta
‑
Mannan
等人
(2015)Drug Metab Dispos[
药物代谢与处置
]43:1882
‑
90)。
这些包括例如天冬酰胺酶
、
瘦素
、
黄体生成素和胆碱酯酶
。
另外，超唾液酸化可以通过屏蔽抗原位点导致非人治疗性蛋白的免疫原性降低
。
[0004]抗体是治疗性蛋白的一个实例，其活性受唾液酸化程度的影响
。
抗体的
Fc
片段在每条重链的
CH2
结构域的天冬酰胺
297
上具有两个保守
N
‑
糖基化位点
。
哺乳动物细胞中产生的单克隆抗体
(Mab)
具有各种糖形，因为附接的聚糖通过核心岩藻糖基化
、
平分型
N
‑
乙酰葡糖胺添加
、
半乳糖基化和唾液酸化在不同程度上被修饰
。
聚糖组成很重要，因为单个单糖残基的存在与否都可以明显影响
Mab
对于不同
Fc
γ
受体的亲和力
。
[0005]在
Fc
聚糖上存在的各种单糖中，末端唾液酸特别令人感兴趣
。Fc
聚糖的唾液酸化显著降低了
Mab
对于经典
Fc
受体的亲和力，从而抑制了抗体依赖性细胞毒性
(ADCC)
，这是一种对几种抗癌抗体的功效至关重要的生物学机制
。
此外，最近对静脉注射免疫球蛋白
(IVIg)
的抗炎特性的研究表明，这种生物活性可能是由于
Fc
聚糖上
α
2,6
‑
唾液酸残基的存在而赋予的
(Kaneko
等人
(2006)Science[
科学
]313:670
‑3；
Anthony
等人
(2008)Science[
科学
]320:373
‑
6)。
因此，可以通过产生含有
α
2,6
‑
连接的唾液酸的重组
IgG
治疗剂来实现增强的抗炎活性
。
不幸的是，
CHO
细胞缺乏负责附接呈
α
2,6
‑
构象的唾液酸的酶，并且仅产生具有
α
2,3
‑
连接的唾液酸的糖蛋白，而且这些糖蛋白的百分比很低
。
[0006]鉴于以上内容，本领域需要提供具有改善的
α
2,6
唾液酸化活性的宿主细胞，尤其是
CHO
细胞
。

技术实现思路

[0007]诸位专利技术人发现唾液酰基转移酶
、
半乳糖基转移酶和唾液酸转运体一起在宿主细胞中的过表达会显著增加细胞的唾液酸化活性
。
尤其是在
CHO
细胞中使用
α
2,6
‑
唾液酰基转
移酶
、
β
1,4
‑
半乳糖基转移酶和
CMP
‑
唾液酸转运体，所产生的糖蛋白中
α
2,6
‑
连接的唾液酸的量显著增加
。
经由用包含全部三个编码序列的一种载体进行稳定转染引入这些酶的基因提供了一种稳定的宿主细胞系
。
通过具有在强启动子的控制下的
α
2,6
‑
唾液酰基转移酶
、
同时
β
1,4
‑
半乳糖基转移酶和
CMP
‑
唾液酸转运体由中等强度启动子控制的载体获得了尤其良好的结果
。
[0008]如诸位专利技术人所示，在此类宿主细胞中产生的蛋白质具有显著增加的唾液酸化，尤其是
α
2,6
‑
连接的唾液酸化的量
。
诸位专利技术人可以进一步证明具有对应高水平的唾液酸化的抗体具有降低的免疫原性
。
抗体的超唾液酸化尤其减少由树突状细胞进行的识别
、
摄取和呈递，并降低
T
细胞激活
。
这转化为抗药物抗体的形成减少，因为更少的
T
辅助细胞和进而更少的
B
细胞被激活
。
因此，治疗性抗体的增加唾液酸化可以减少不良副作用，特别是由患者针对治疗性抗体的免疫应答引起的副作用
。
[0009]鉴于以上内容，在第一方面中，本专利技术涉及一种哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞被工程化以用于增加
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶
、
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶和
CMP
‑
唾液酸转运体的表达
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以用于增加
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶
、
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶和
CMP
‑
唾液酸转运体的表达
。2.
根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含
(i)
编码
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶的外源核酸；
(ii)
编码
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶的外源核酸；以及
(iii)
编码
CMP
‑
唾液酸转运体的外源核酸
。3.
根据权利要求2所述的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含
(i)
包含可操作地连接至
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶的编码序列的第一启动子的第一外源表达盒；
(ii)
包含可操作地连接至
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶的编码序列的第二启动子的第二外源表达盒；以及
(iii)
包含可操作地连接至
CMP
‑
唾液酸转运体的编码序列的第三启动子的第三外源表达盒
。4.
根据权利要求1所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞的编码
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶
、
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶和
CMP
‑
唾液酸转运体的内源基因被工程化以用于增加表达
。5.
根据权利要求4所述的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含
(i)
可操作地连接至
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶的内源编码序列的第一外源启动子；
(ii)
可操作地连接至
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶的内源编码序列的第二外源启动子；
(i)
可操作地连接至
CMP
‑
唾液酸转运体的内源编码序列的第三外源启动子
。6.
根据权利要求3或5所述的哺乳动物细胞，其中所述第一启动子是强启动子
。7.
根据权利要求
3、5
和6中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述第一启动子是巨细胞病毒
(CMV)
启动子
。8.
根据权利要求3和5至7中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述第二启动子和
/
或所述第三启动子选自下组，该组由以下组成：猿猴病毒
40(SV40)
启动子
、CMV
启动子
、
泛素
C(UBC)
启动子
、
延伸因子1α
(EF1A)
启动子
、
磷酸甘油酸激酶
(PGK)
启动子和与
CMV
早期增强子偶联的
β
‑
肌动蛋白启动子
(CAGG)
，特别是
SV40
启动子
。9.
根据权利要求1至8中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶是
β
‑
半乳糖苷
α
‑
2,6
‑
唾液酰基转移酶
1(ST6GAL1)
，特别地衍生自中国地鼠或人；所述
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶是
β
‑
1,4
‑
半乳糖基转移酶
1(B4GALT1)
，特别地衍生自中国地鼠或人；并且所述
CMP
‑
唾液酸转运体是
CMP
‑
唾液酸转运体
(SLC35A1)
，特别地衍生自中国地鼠或人
。10.
根据权利要求1至9中任一项所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是啮齿动物细胞或人细胞，特别是中国仓鼠卵巢
(CHO)
细胞
。11.
根据权利要求1至
10
中任一项所述的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞进一步包含用于重组表达糖基化多肽的外源表达盒
。12.
一种用于产生糖基化多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)
提供根据权利要求
11
所述的哺乳动物细胞；
(b)
在允许表达所述糖基化多肽的条件下，在细胞培养物中培养所述哺乳动物细胞；
(c)
从所述细胞培养物中获得所述糖基化多肽；以及
(d)
任选地加工所述糖基化多肽
。13.
根据权利要求
12
所述的方法，其中在所述哺乳动物细胞的培养期间的培养条件不包括超过
2℃
的温度变化，特别地不包括超过
1℃
的温度变化
。14.
根据权利要求
12
或
13
所述的方法，其中在所述哺乳动物细胞的培养期间，温度保持在
35℃
至
38℃
的范围内
。15.
根据权利要求
12
至
14
中任一项所述的方法，其中步骤
(d)
包括提供包含所述糖基化多肽的药物配制品
。16.
根据权利要求
12
至<...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：