一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法技术

本发明专利技术涉及一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法

【技术实现步骤摘要】
一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法


[0001]本专利技术属于胚胎体外处理方法
，具体涉及一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法
。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术
。
[0003]奶业发达国家的经验表明，优秀种公牛对奶牛群体遗传改良的贡献率超过
75
％
。
传统的奶牛群体遗传改良靠使用种公牛的冻精进行人工授精实现，但是这种方式只能利用种公牛的遗传优势，母牛的繁殖潜力及其在奶牛群体遗传改良中的作用未得到充分发挥
。
利用胚胎移植技术，可最大限度的利用种公牛及母牛的遗传资源，发挥双方的遗传优势
。
使用胚胎移植技术一个世代即可实现使用冻精几个世代的遗传改良效果，增加高产奶牛数量，提高全群奶牛生产水平
。
[0004]胚胎移植技术涉及到两种来源的胚胎：体内胚及体外胚
。
体外胚是目前商业可及的最快推进奶牛遗传进展的工具，在我国具有非常广阔的应用前景和发展潜力
。
但是目前奶牛体外胚胎在国内的应用远不及体内胚，原因在于，奶牛体外胚移植受胎率比体内胚低
10
％
。
因此，提高奶牛体外胚移植受胎率，降低体外胚应用成本，是关系到我国奶牛产业发展水平，推进奶牛遗传进展的重要一环
。
[0005]胚胎孵出困难是导致奶牛体外胚着床失败
、
移植受胎率低的重要因素
。
较长的体外培养时间
、
不理想的体外培养环境等都会导致奶牛体外胚外层的透明带厚度增加
、
透明带硬化等，进而使得体外胚胎孵出困难
。
因此，亟需开发一种新的方法，改变奶牛体外胚透明带硬化的情况，人为的达到帮助胚胎孵化，促进胚胎着床
、
提高胚胎移植受胎率的方法
。

技术实现思路

[0006]针对上述技术现状，本专利技术目的在于通过优化奶牛胚胎体外培养技术，提高体外培养过程中的孵化率，进而提高移植受胎率
。
为了实现上述技术目的，本专利技术在胚胎体外培养过程中引入了辅助孵化及玻璃化冷冻处理方式，通过人为在胚胎透明带上制造裂隙，以消除透明带硬化导致的着床失败
。
同时，通过制备裂隙帮助后续冷冻过程中胚胎快速平衡，从而有效提高胚胎孵化率，促进着床
。
[0007]基于上述技术效果，本专利技术提供一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法，包括如下步骤：对奶牛体外胚胎进行辅助孵化，将完成辅助孵化的胚胎冷冻，解冻后移植；
[0008]所述辅助孵化的方式如下：固定胚胎，在胚胎卵周隙较大处或细胞碎片较多处制造裂隙，该裂隙占透明带周长长度四分之一至三分之一；
[0009]所述冷冻的方式如下：将完成辅助孵化的胚胎依次移入冷冻平衡液及冷冻液中静置，装载至载体后投入液氮中进行冷冻
。
[0010]上述孵化方法主要适用的对象为囊胚期的体外胚胎，本专利技术对上述孵化方法的主要改进点在于：
[0011](1)
本专利技术通过人为制造裂隙减少了透明带厚度增加
、
透明带硬化对胚胎孵出的不良影响；在辅助孵化的具体实施方式中，本专利技术优选人工操作的方式，通过固定针固定胚胎，通过操作针穿入
、
穿出的方式进行温和
、
精准的裂隙制备
。
现有工艺中多采用激光打孔方式在胚胎中制备裂隙，本专利技术利用显微操作针制造裂隙的方法与激光制备裂隙相比，优势在于：
①
不用配备额外配备价格昂贵的激光破膜仪
②
激光破膜操作过程中，由于激光打孔会对胚胎细胞造成热损伤，使用本专利技术提供的方法能避免激光导致的热损伤
。
[0012]一种实施方式中，所述辅助孵化的操作方式如下：将培养至囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入液滴中，通过固定针固定胚胎，操作针穿入胚胎，沿卵周隙较大处或细胞碎片处位置穿出制造裂隙
。
[0013]进一步的，所述液滴制备方式如下：将孵化操作液滴在操作平台，其上覆盖
sigma M5310
，所述孵化操作液以
TCM199
为基础液，添加8～
12
％的
FBS。
[0014]进一步的，适用于上述操作步骤的固定针内径为
25
‑
30
μ
m
，具有
25
～
35
度的弯折，操作针应当具有较为锐利的针尖，从而方便的穿入
、
穿出胚胎，并且操作针针头与握持部位应当具有
25
～
35
度的弯折
。
[0015](2)
在冷冻操作中，与未经过辅助孵化胚胎的玻璃化冷冻相比，经过辅助孵化操作后的胚胎透明带上形成裂隙，冷冻过程中，冷冻液渗透速度明显加快，能经过更短的时间达到平衡状态，因此，经过辅助孵化后的胚胎平衡时间明显缩短，由常规
15
分钟缩短为4‑7分钟
。
[0016]本专利技术提供的一种实施方式中，提供一种玻璃化冷冻方法，具体操作如下：将完成辅助孵化的胚胎放入冷冻平衡液中静置4～
7min
，之后移入冷冻液中静置
35
～
55
秒，之后移入载体中，投入液氮进行冷冻；解冻时，取出载体快速没入解冻液中，胚胎脱落后继续停留4～
7min
完成解冻过程
。
[0017]该实施方式中，所述冷冻液以上述孵化操作液为基础，添加体积百分比为8～
12
％的乙二醇
、
体积百分比为8～
12
％的二甲基亚砜
、0.2
～
0.3M
的蔗糖；所述冷冻液以上述孵化操作液为基础液，添加体积百分比为
18
～
22
％的乙二醇
、
体积百分比为
18
～
22
％的二甲基亚砜
、0.4
～
0.6M
的蔗糖；对应的，所述解冻液为以上述孵化操作液为基础，添加
0.4
～
0.6M
的蔗糖
。
[0018]上述玻璃化冷冻方式具有冷冻效果好的优势，但是其解冻过程对时间和操作的要求更加严格，考虑到实际生产工程中，可能遇到大量处理解冻胚胎的情形，本专利技术还提供了一种解冻操作更为简便的程序性冷冻方法，具体操作如下：将完成辅助孵化后的胚胎放在冷冻平衡液滴表面，待胚胎沉入液滴中，吸取胚胎放在冷冻液表面，待胚胎沉入，将含有胚胎的冷冻液移入麦管中，两端分别通过不连续的冷冻液进行封装，封装好的麦管装入程序控温仪中，启动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高受胎率的奶牛体外胚胎孵化方法，其特征在于，包括如下步骤：对奶牛体外胚胎进行辅助孵化，将完成辅助孵化的胚胎冷冻，解冻后移植；所述辅助孵化的方式如下：固定胚胎，在胚胎卵周隙较大处或细胞碎片较多处制造裂隙，该裂隙占透明带周长长度四分之一至三分之一；所述冷冻的方式如下：将完成辅助孵化的胚胎依次移入冷冻平衡液及冷冻液中静置，装载至载体后投入液氮中进行冷冻
。2.
如权利要求1所述方法，其特征在于，所述辅助孵化的操作方式如下：将培养至囊胚阶段的奶牛体外胚胎移入液滴中，通过固定针固定胚胎，操作针穿入胚胎，沿卵周隙较大处或细胞碎片处位置穿出制造裂隙
。3.
如权利要求2所述方法，其特征在于，所述液滴制备方式如下：将孵化操作液滴在操作平台，其上覆盖
sigma M5310
，所述孵化操作液以
TCM199
为基础液，添加8～
12
％的
FBS。4.
如权利要求2所述方法，其特征在于，所述固定针内径为
25
‑
30
μ
m
，具有
25
～
35
度的弯折；所述操作针针头与握持部位具有
25
～
35
度的弯折
。5.
如权利要求1所述方法，其特征在于，所述冷冻为玻璃化冷冻方式，具体步骤如下：将完成辅助孵化的胚胎放入冷冻平衡液中静置4～
7min
，之后移入冷冻液中静置
35
～
55
秒，再移入载体中，投入液氮进行冷冻；解冻时，取出载体快速没入解冻液中，胚胎脱落后继续停留4～
7min
完成解冻过程
。6.
如权利要求5所述方法，其特征在于，所述冷冻液以权利要求3中所述的孵化操作液为基础，添加体积百分比为8～
12
％的乙二醇
、
体积百分比为8～
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕，马庆涛，王玲玲，高运东，
申请(专利权)人：山东奥克斯畜牧种业有限公司，
类型：发明
国别省市：