用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种利用渗透压由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的方法，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加蔗糖

【技术实现步骤摘要】
200、
葡萄糖等
。
[0013]在本专利技术的第四方面，提供利用渗透压提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的培养基，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加蔗糖
、PEG 300
的至少一种
。
[0014]进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～
100ng/ml Activin A、B27、
牛血清白蛋白，以及蔗糖
、PEG 300
中的至少一种
。
[0015]进一步地，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～
100ng/ml Activin A、0.5
～
1.5
％ B27、0.1
～
0.3
％牛血清白蛋白，以及以下化合物中的一种：
[0016]化合物
A
：1～3％蔗糖；
[0017]化合物
B
：1～2％ PEG 300
；
[0018]进一步地，所述培养基的组分还包括：2～
3mM GSK3
抑制剂
。
具体地，
GSK3
抑制剂可以为例如
CHIR99021
或者
Wnt
信号传导激活剂，例如
Wnt3A。
[0019]在其他实施方式中，所述培养基还可包含组蛋白脱乙酰酶
(HDAC)
抑制剂，例如，曲古抑菌素
A、
丁酸钠
(NaB)、/>恩替司他
(Entinostat)、
丁酸苯酯
(PB)、
帕比司他
(Panobinstat)
或丙戊酸盐
/
酯
(valproate)。
所述分化培养基还可包含一种或更多种生长因子，例如
FGF1、FGF2
和
FGF4
和
/
或血清，例如
FBS
或
FCS。
所述分化培养基还可包含
PI3K(
磷酸肌醇3‑
激酶
)
抑制剂，例如
LY294002。
[0020]进一步地，所述哺乳动物多能干细胞的类型包括：哺乳动物胚胎干细胞或哺乳动物诱导多能干细胞
。
[0021]具体地，所述哺乳动物多能干细胞包括：人多能干细胞
、
灵长类动物多能干细胞
、
小鼠多能干细胞
、
大鼠多能干细胞
、
犬多能干细胞
、
猫多能干细胞
、
猪多能干细胞
、
牛多能干细胞和马多能干细胞中的一种
。
[0022]在本专利技术的第五方面，提供一种哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养方法，所述方法包括：采用所述的培养基对哺乳动物多能干细胞进行培养，以使分化成定型内胚层细胞
。
[0023]进一步地，所述方法包括：
[0024]将哺乳动物多能干细胞使用生长培养基进行培养3～6天，后消化计数并接种于包被有基质胶的孔板内，采用正常生长培养基培养；
[0025]待达到
75
～
85
％的密度，换上所述的培养基进行培养，获得定型内胚层细胞
。
[0026]上述技术方案中，所述生长培养基具体可以为
mTeSR+1
％双抗，基质胶以1：
100
稀释比例包被于板孔内，在其他实施方式中也可适当调整添加比例；
[0027]上述技术方案中，对于
24
孔板，所述消化计数后按
0.8X105每孔的密度将细胞接种于包被有基质胶的
24
孔板内；在其他实施方式中，对于不同的培养皿，适当相应调整接种的细胞数
。
[0028]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0029]本专利技术提供的利用渗透压提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的培养基和培养方法，通过向基本培养基中添加蔗糖
、PEG 300
中的至少一种，以提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率；具体地：
[0030](1)
培养基中加入蔗糖
、PEG 300
中的至少一种，使多能干细胞分化第3天时即可达
到较高的分化效率，可以缩短分化时间
。
[0031](2)
本专利技术提供的培养基，成本较低，性能稳定，可以将人多能干细胞高效率地分化为定型内胚层细胞
。
这为体外进行内胚层相关发育问题的研究提供了一个低成本高效率的研究体系
。
同时也降低了再生医学的应用成本，这将极大地促进细胞疗法的研究与应用，有着很好的应用前景
。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图
。
[0033]图1为实施例1和对比例1对比显示的蔗糖对人胚胎干细胞朝向内胚层分化阳性率影响的流式结果；
[0034]图2为实施例2和对比例2对比显示的蔗糖对人胚胎干细胞朝向内胚层分化标志基因表达影响的免疫荧光统计结果；
[0035]图3为实施例3和对比例3对比显示的蔗糖对人胚胎干细胞朝向内胚层分化标志基因表达影响的定量
PCR
结果；
[0036]图4为实施例4和对比例4对比显示的
PEG 300
对人胚胎干细胞朝向内胚层分化阳性率影响的流式结果；
[0037]图5为实施例
2、
实施例5和对比例5对比显示的在
IMDM/F12
基础培养基中，蔗糖和
PEG 300
的对人胚胎干细胞朝向内胚层分化阳性率影响的流式结果；
[0038]图6为实施例
6、
实施例7和对比例6对比显示的在
DMEM
基础培养基中，蔗糖和
PEG 300
的对人胚胎干细胞朝向内胚层分化阳性率影响的流式结果；
[0039]图7为本专利技术实施例提供的一种利用渗透压由人多能干细胞分化获得定型内胚层细胞的培养方法的流程模式图
。
具体实施方式
[0040]下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现
。
本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术
。
[0041]在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种蔗糖的应用，其特征在于，所述应用包括：加入蔗糖提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率
。2.
一种
PEG 300
的应用，其特征在于，所述应用包括：加入
PEG 300
提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率
。3.
一种利用渗透压提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的方法，其特征在于，所述方法包括添加化合物蔗糖
、PEG 300
中的至少一种
。4.
一种利用渗透压提高哺乳动物多能干细胞分化培养成定型内胚层细胞的分化效率的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加蔗糖和
PEG 300
中的至少一种
。5.
根据权利要求4所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加
100ng/mlActivin A、B27、
牛血清白蛋白，以及蔗糖
、PEG 300
中的至少一种
。6.
根据权利要求5所述的一种用于哺乳动物多能干细胞分化成定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括：在基础培养基上添加1～
100ng/mlActivin A、0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋卫，姜来，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：