一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA可变剪切
‑
荧光素酶报告系统及其应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物学领域，具体地说，本专利技术涉及一种荧光素酶报告系统及其应用，特别涉及一种特异性筛选分子或基因是否参与植物
mRNA
可变剪切过程的荧光素酶报告系统及其应用，可用于对外源分子或植物内源基因是否参与植物
mRNA
的可变剪切过程进行快速筛选
。

技术介绍

[0002]可变剪切（
Alternative Splicing, AS
）是指同一种前体
mRNA
（
pre
‑
mRNA
）通过不同剪接方式产生不同
mRNA
的过程
。
真核生物绝大多数基因的
pre
‑
mRNA
都需要经过一系列复杂的加工，如内含子剪切
、 5
’
端加帽
、3
’
端加尾等，才能产生成熟的
mRNA
以执行相关功能
。
通过可变剪切，同一个基因可以产生多种不同的
mRNA
，进而翻译成不同的蛋白质，从而增加高等生物中基因表达的复杂程度
。
近年不断改良的测序技术提供了更多证据表明，可变剪切在生物的环境适应和生长发育过程中发挥重要作用
。
据研究表明，可变剪切能够参与调控植物免疫反应
。
比如，可变剪切能调控植物细胞表面模式识别受体（
PRRs
）识别病原物相关分子模式（
PAMPs
）的敏感性，病原物中也存在效应分子干扰植物可变剪切进而抑制植物免疫反应的现象，植物一些抗病基因也需要发生可变剪切才能发挥功能
。
可变剪切在植物和病原微生物的相互作用中占据着重要地位，然而目前植物可变剪切的研究领域缺乏相关的
mRNA
可变剪切系统，这严重限制着植物中剪切相关蛋白的功能研究和植物中
RNA
可变剪切的作用机制研究
。
因此，开发一种新型的植物体内
mRNA
可变剪切报告系统是加速植物可变剪切作用机制研究的有效途径
。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统及其应用
。
[0004]本专利技术的另一目的在于提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体及其构建方法
。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的转基因植物的培育方法
。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统，该报告系统包含植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
（一个在免疫激活下会发生
RNA
剪切的基因片段）和荧光素酶报告基因
LUC
；所述植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述荧光素酶报告基因
LUC
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，该
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体，该表达载体是将所述的植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
和荧光素酶报告基因
LUC
一起连接到植物表达载体
pK7WGF2
中，得到的表达载体
pK7WGF2:UNMA
‑
LUC
，该载体适用于转化
多种植物
。
[0009]进一步的，上述表达载体的构建过程包括以下步骤：（1）提取马铃薯的基因组
DNA
，利用如
SEQ ID NO.5
和
SEQ ID NO.6
所示的引物扩增出植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
，获得如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列；（2）利用如
SEQ ID NO.7
和
SEQ ID NO.8
所示的引物扩增出荧光素酶报告基因
LUC
，获得如
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列； （3）利用多片段重组的方法，将植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
和荧光素酶报告基因
LUC
连接到植物表达载体
pK7WGF2
中，获得
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体
pK7WGF2:UNMA
‑
LUC
；所述的
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体全序列为
SEQ ID NO.4。
[0010]第三方面，本专利技术提供一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统转基因植物的培育方法，将上述的表达载体
pK7WGF2:UNMA
‑
LUC
在植物上进行稳定转化，通过抗性筛选和荧光素酶活性验证的方法获得稳定过表达
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的转基因植物
。
[0011]第四方面，上述的
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统，上述的表达载体，或者上述方法培育的转基因植物在快速筛选通过可变剪切过程调控免疫反应的植物诱抗分子和抗病元件中的应用也属于本专利技术的保护范围
。
[0012]进一步的，上述的应用中所述快速筛选的方法为（1）或（2）：（1）培育稳定过表达上述
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的转基因植物，向所述转基因植物的叶片上喷洒待测分子，通过检测荧光素酶活性来判断待测分子是否参与植物的可变剪切过程，实现待测分子是否参与植物可变剪切过程的快速筛选；（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统，其特征在于，该报告系统包含植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
和荧光素酶报告基因
LUC
；所述植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述荧光素酶报告基因
LUC
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，该
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。2.
一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体，其特征在于，该表达载体是将权利要求1中所述的植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
和荧光素酶报告基因
LUC
一起连接到植物表达载体
pK7WGF2
中，得到的表达载体
pK7WGF2:UNMA
‑
LUC。3.
根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其构建过程包括以下步骤：（1）提取马铃薯的基因组
DNA
，利用如
SEQ ID NO.5
和
SEQ ID NO.6
所示的引物扩增出植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
，获得如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列；（2）利用如
SEQ ID NO.7
和
SEQ ID NO.8
所示的引物扩增出荧光素酶报告基因
LUC
，获得如
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列；（3）利用多片段重组的方法，将植物抗病基因
Rpi
‑
vnt1.1
的可变剪切区域
UNMA
和荧光素酶报告基因
LUC
连接到植物表达载体
pK7WGF2
中，获得
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统的表达载体
pK7WGF2:UNMA
‑
LUC。4.
一种
mRNA
可变剪切
‑
荧光素酶报告系统转基因植物的培育方法，其特征在于，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：董莎萌，高楚云，孟曦，高汉峰，李康平，孙碧莹，
申请(专利权)人：南京农业大学三亚研究院，
类型：发明
国别省市：