代替荧光蛋白的可视化质粒及其相关应用制造技术

本申请属于生物工程技术领域，具体涉及代替荧光蛋白的可视化质粒及其相关应用

【技术实现步骤摘要】
代替荧光蛋白的可视化质粒及其相关应用


[0001]本申请属于生物工程
，具体涉及三种代替荧光蛋白的可视化质粒及其制备方法和应用，以及一种利用可视化质粒代替荧光蛋白评价植物原生质体转化及转化效率的可视化方法
。

技术介绍

[0002]植物的原生质体在生物工程领域可以用于瞬时的遗传转化
、
体细胞融合和植株再生
。
[0003]目前，许多物种中都成功建立了
PEG
介导的原生质体瞬时转化技术，该技术可以应用于生物大分子定位
、
互作，基因编辑工具开发以及单细胞测序等
。
[0004]原生质体瞬时转化技术包括原生质体的分离
、
纯化
、
转化和转化效率评价这四个主要步骤，其中转化效率评价是原生质体转化实验中必不可少的质控步骤
。
[0005]据了解目前几乎所有的评价方法都是基于荧光蛋白的，如
GFP、RFP、mCherry
等
。
[0006]主要原理是转化成功的原生质体细胞表达质粒上的荧光蛋白，在荧光激发光下产生荧光，与无荧光细胞对比即可计算出转化效率
。
[0007]但在实际操作中，往往只需知道转化是否成功，来排除试剂配置和操作失误的问题，从而及时终止后续实验以避免浪费时间
。
[0008]这种基于荧光蛋白的方法不能在普通光学显微镜下快速进行观察，并且需要依赖昂贵的激发光源设备和额外的操作步骤
。
[0009]目前尚未出现技术成熟的使用非损伤
、
肉眼可见的技术方法来评价原生质体的转化效率的应用技术
。
[0010]甜菜红素和甜菜黄素是石竹目植物特有的植物色素
。
[0011]其合成途径是以酪氨酸为底物，经
P450
氧化酶（
CYP76AD1
）羟基化转变为
L
‑
3 ,4
‑
二羟基苯丙氨酸（
L
‑
DOPA
），
L
‑
DOPA
可被
CYP76AD1
进一步氧化为
cyclo
‑
DOPA。
[0012]L
‑
DOPA
还可被
L
‑
DOPA 4
，5‑
二加氧酶（
DODA
）转变为甜菜酸（
Betalamic acid
），甜菜酸一方面可与
cyclo
‑
DOPA
在葡萄糖基转移酶（
GT
）催化下产生甜菜红素，另一方面可与氨基酸或氨基基团自发反应形成甜菜黄素
。
[0013]因此理论上来说，只需要
CYP76AD1
，
DODA
和
GT
三个基因就可以在生物体内重构甜菜红素和甜菜黄素的代谢通路
。
[0014]近些年，相关研究利用甜菜红素系统，将这三个基因通过自剪切多肽进行融合表达，形成人工合成的
Ruby
基因，成功应用于转基因植株的可视化筛选
。
[0015]目前该从头合成策略不仅在烟草
、
棉花等植物中成功应用，在酵母
、
家蚕中也同样成功应用
。
[0016]此外，甜菜红素和甜菜黄素不仅具有肉眼可见的红色和黄色，在绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的激发波长范围内同样有对应的强烈自发荧光
。
[0017]但是现有研究中
Ruby
基因并未见作为原生质体的报告基因，可能存在四个主要的
原因：（1）
Ruby
基因长达
3951 bp
，而多数原生质体转化系统存在质粒越大转化效率越低的情况，（2）有研究表明位于自剪切多肽后方的基因表达量会低于前方的基因，因此通过单个表达框表达
Ruby
，在原生质体这种瞬时转化系统中可能无法积累足够的甜菜色素
。
[0018]（3）与转基因植物中有持续的
Ruby
代谢前体物质酪氨酸不同，原生质体分离后无额外的酪氨酸来源
。
[0019]同时
Ruby
基因在表达过程中涉及多种中间代谢物，可能存在中间代谢物运出细胞或进入其它代谢方向导致最终不能积累足够的甜菜色素导致无法肉眼可见细胞变色
。
[0020]（4）现阶段虽然可以通过外源施加底物的方式进行补充，但使用常规的施加方法（如转化后的孵育阶段施加）未见或极少见转化
Ruby
后的细胞出现颜色
。
[0021]综上，现有的技术不能在原生质体中通过质粒转化稳定积累并使用甜菜色素
。

技术实现思路

[0022]有鉴于此，本专利技术提供了三种代替荧光蛋白的可视化质粒及其制备方法和应用，以及一种利用可视化质粒代替荧光蛋白评价植物原生质体转化及转化效率的可视化方法
。
[0023]相较于现行的荧光蛋白报告系统对于激发光源设备依赖的局限性，本专利技术提供的质粒
、
可视化方法及相关应用是一种非损伤，低成本，肉眼可见的原生质体转化报告系统，利用原生质体代谢底物
L
‑
DOPA
产生甜菜红素和甜菜黄素，设计了新型的原生质体转化报告系统
。
[0024]在本专利技术中命名为
BTX 报告系统
。
[0025]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：本专利技术提供了代替荧光蛋白的可视化质粒，所述可视化质粒包括
pUC
‑
Ruby、pUC
‑
tdDODA
和
pUC
‑
DODA
；所述可视化质粒
pUC
‑
Ruby
中代替荧光蛋白的基因包括
Ruby
基因；在本专利技术中，所述
Ruby
基因中包括
CYP76AD1
基因
、DODA
基因和
GT
基因；所述
CYP76AD1
基因表达的
CYP76AD1
蛋白的氨基酸序列如专利
CN 112063649 A
中
SEQ ID NO.1
所示；所述
DODA
基因如
SEQ ID NO.2
所示：所述
GT
基因表达的
GT
蛋白的氨基酸序列如专利
CN 112063649 A
中
SEQ ID NO.3
所示所述可视化质粒
pUC
‑
tdDODA
中代替荧光蛋白的基因包括如<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
代替荧光蛋白的可视化质粒，其特征在于，所述可视化质粒为可视化质粒
pUC
‑
tdDODA
和可视化质粒
pUC
‑
DODA
；所述可视化质粒
pUC
‑
tdDODA
中代替荧光蛋白的基因包括如
SEQ ID NO.1
所示的
tdTomato
基因和如
SEQ ID NO.2
所示的
DODA
基因；所述可视化质粒
pUC
‑
DODA
中代替荧光蛋白的基因包括如
SEQ ID NO.2
所示的
DODA
基因；所述可视化质粒的载体骨架包括
pUC
系列的载体骨架；所述载体骨架上还包括启动子
35S
和终止子为
NOS
；所述可视化质粒
pUC
‑
tdDODA
中
tdTomato
基因和
DODA
基因利用如
SEQ ID NO.3
所示的
DNA
连接单元连接；扩增所述
tdTomato
基因的引物如
SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋国立，郝云飞，李媛媛，袁张程，刘记，左东云，王巧连，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：