一种利用番茄制造技术

本发明专利技术公开了一种利用番茄

【技术实现步骤摘要】
一种利用番茄SlDHS2和SlAS基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法
。

技术介绍

[0002]人体所需的8种必需氨基酸中有2种氨基酸
(
苯丙氨酸
Phenylalanine
，
Phe、
色氨酸
Tryptophan
，
Trp)
都是由植物芳香族氨基酸的莽草酸途径
(Shikimate pathway)
代谢合成的
。
因此，想要提高必需氨基酸的含量，可以利用植物的莽草酸途径进行改造和编辑
。
植物的莽草酸途径中有至少两个关键的节点受代谢产物的负反馈调节，分别是催化磷酸烯醇式丙酮酸
(Phosphoenolpyruvate
，
PEP)
和赤藓糖
‑4‑
磷酸
(D
‑
erythrose 4
‑
phosphate
，
E4P)
缩合的
DAHP
合成酶
(DHS)
，及催化分支酸
(Chorismate)
进入色氨酸合成途径的邻氨基苯甲酸合成酶
(AS)。
其中
DHS
受到下游产物色氨酸
、
分支酸及酪氨酸的负反馈调节，而
AS
也受到色氨酸含量的负反馈调节，因此正常情况下，植物体内无法形成大量的色氨酸等必需氨基酸
。
[0003]研究发现，
DHS
基因与
AS
基因中存在一些负反馈调节的关键位点，在拟南芥等植物的突变体中负反馈调节可以被解除
。
在模式植物拟南芥中，找到了
DHS
基因的6个关键位点，对其进行定点突变后可解除下游不同物质的负反馈调节作用，而拟南芥突变体
trp5
中证明1个位点的突变就可以解除色氨酸对
AS
基因的负反馈调节作用，从而使下游色氨酸的含量显著提高
。
但是，在植物中，合理的利用
DHS
基因与
AS
基因中关键位点，对其进行突变，是否可以达到调节植物的莽草酸途径，提高必需氨基酸含量的目的，还需验证和研究
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术中的不足，并提供一种利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法
。
本专利技术选取番茄中
SlDHS2
基因的4个关键位点和
SlAS
基因的1个关键位点，对其进行定点突变，将突变后的基因序列构建到植物瞬时转化的表达载体中，对本氏烟草进行瞬时转化，提取转化后的本氏烟草叶片中的氨基酸，利用多反应监测模式
(MRM)
的方法测定氨基酸的含量，发现烟草叶片中6种必需氨基酸的含量均得到显著提高
。
[0005]本专利技术所采用的具体技术方案如下：
[0006]本专利技术提供一种利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，包括以下步骤：
[0007]S1
：选取番茄
SlDHS2
基因的4个关键位点和
SlAS
基因的1个关键位点，其中：
[0008]所述番茄
SlDHS2
基因的基因号为
Solyc04g074480
，将其
CDS
序列中第
761
个核苷酸由
C
突变为
T
，使编码的第
254
个氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸；第
772
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
258
个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第
775
个核苷酸由
G
突变
A
，使编码的第
259
个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第
781
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
261
个氨基酸由
丙氨酸突变为苏氨酸；最终设计得到如
SEQ ID NO.1
所示的突变的番茄
SlDHS2m
序列；
[0009]所述番茄
SlAS
基因的基因号为
Solyc06g006100
，将其
CDS
序列中第
997
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
333
个氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终设计得到如
SEQ ID NO.2
所示的突变的番茄
SlASm
序列；
[0010]S2
：基于植物瞬时表达载体
pTE
，分别结合突变的番茄
SlDHS2m
序列和突变的番茄
SlASm
序列，构建番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变的烟草瞬时表达载体，并转化大肠杆菌进行测序，得到包含正确位点突变序列的瞬时表达载体质粒
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
；
[0011]S3
：采用瞬时转化法，将
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
载体质粒转入农杆菌中，同时在本氏烟草中表达
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
载体
。
[0012]作为优选，所述
S2
中，植物瞬时表达载体
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
的构建方法如下：
[0013]S21
：利用同源重组的方法，将突变位点设计至引物中，将突变的番茄
SlDHS2m
序列和突变的番茄
SlASm
序列分别分成2段进行
PCR
扩增，从而引入突变位点，所设计的引物如下：
[0014]使用引物
SlDHS2
‑
Q
‑
1F、SlDHS2
‑
Q
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1
：选取番茄
SlDHS2
基因的4个关键位点和
SlAS
基因的1个关键位点，其中：所述番茄
SlDHS2
基因的基因号为
Solyc04g074480
，将其
CDS
序列中第
761
个核苷酸由
C
突变为
T
，使编码的第
254
个氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸；第
772
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
258
个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第
775
个核苷酸由
G
突变
A
，使编码的第
259
个氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸；第
781
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
261
个氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸；最终设计得到如
SEQ ID NO.1
所示的突变的番茄
SlDHS2m
序列；所述番茄
SlAS
基因的基因号为
Solyc06g006100
，将其
CDS
序列中第
997
个核苷酸由
G
突变为
A
，使编码的第
333
个氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终设计得到如
SEQ ID NO.2
所示的突变的番茄
SlASm
序列；
S2
：基于植物瞬时表达载体
pTE
，分别结合突变的番茄
SlDHS2m
序列和突变的番茄
SlASm
序列，构建番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变的烟草瞬时表达载体，并转化大肠杆菌进行测序，得到包含正确位点突变序列的瞬时表达载体质粒
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
；
S3
：采用瞬时转化法，将
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
载体质粒转入农杆菌中，同时在本氏烟草中表达
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
载体
。2.
根据权利要求1所述的利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，所述
S2
中，植物瞬时表达载体
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm
的构建方法如下：
S21
：利用同源重组的方法，将突变位点设计至引物中，将突变的番茄
SlDHS2m
序列和突变的番茄
SlASm
序列分别分成2段进行
PCR
扩增，从而引入突变位点，所设计的引物如下：使用引物
SlDHS2
‑
Q
‑
1F、SlDHS2
‑
Q
‑
1R
和
SlDHS2
‑
Q
‑
2F、SlDHS2
‑
Q
‑
2R
分别扩增序列如
SEQ ID NO.3
所示的
SlDHS2m
‑1基因片段
、
序列如
SEQ ID NO.4
所示的
SlDHS2m
‑2基因片段；使用引物
SlAS
‑
Q
‑
1F、SlAS
‑
Q
‑
1R
和
SlAS
‑
Q
‑
2F、SlAS
‑
Q
‑
2R
分别扩增序列如
SEQ ID NO.5
所示的
SlASm
‑1基因片段以及序列如
SEQ ID NO.6
所示的
SlASm
‑2基因片段；所述引物
SlDHS2
‑
Q
‑
1F、SlDHS2
‑
Q
‑
1R、SlDHS2
‑
Q
‑
2F、SlDHS2
‑
Q
‑
2R、SlAS
‑
Q
‑
1F、SlAS
‑
Q
‑
1R、SlAS
‑
Q
‑
2F
和
SlAS
‑
Q
‑
2R
的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO.7
～
14
所示；所述
PCR
扩增过程中，按照所设计的引物，以栽培番茄
M82
叶片的
cDNA
为模板，使用高保真酶
KOD
进行
PCR
扩增后回收纯化，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后得到纯化的
SlDHS2m
‑1基因片段
、SlDHS2m
‑2基因片段
、SlASm
‑1基因片段以及
SlASm
‑2基因片段；
S22
：基于植物瞬时表达载体
pTE
，采用反向
PCR
方法获得载体片段，具体方法如下：使用高保真酶
KOD
进行
PCR
扩增，模板采用
pTE
‑
HT
空载质粒，所用引物为序列如
SEQ ID NO.15
所示的
pTE
‑
F
和序列如
SEQ ID NO.16
所示的
pTE
‑
R
；扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，得到纯化的
pTE
载体片段；
S23
：使用同源重组的方法进行载体连接，具体方法如下：将纯化的
SlDHS2m
‑1基因片段和
SlDHS2m
‑2基因片段与
pTE
载体片段进行连接反应，得到第一连接液；将纯化的基因片段
SlASm
‑1基因片段和
SlASm
‑2基因片段与
pTE
载体片段进行连接反应，得到第二连接液；将所述第一连接液和第二连接液分别转入不同的大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞中，并置于含有卡那霉素的抗性
LB
培养基中培养，再对生长的菌落进行
PCR
鉴定，将
PCR
阳性的菌落振荡培养后
提取质粒，进行测序，分别得到正确突变序列的瞬时表达载体质粒
pTE
‑
SlDHS2m
和
pTE
‑
SlASm。3.
根据权利要求2所述的利用番茄
SlDHS2
和
SlAS
基因位点突变提高植物6种必需氨基酸的方法，其特征在于，步骤
S21
中所述
PCR
扩增反应体系为：
KOD
高保真酶
25uL
，正向引物
2uL
，反向引物
2uL
，
M82
叶片
cDNA
：
2uL
，并加水至
50uL
；反应程序为：
98℃
预变性
2min
，
98℃
变性
10s
，
65℃
退火
10s
，
68℃
延伸
30s
，变性
、
...

【专利技术属性】
技术研发人员：范鹏祥，姜丽娜，高逸飞，金建峰，张文轩，
申请(专利权)人：上海浙江大学高等研究院，
类型：发明
国别省市：