利用多基因编辑技术创制高制造技术

本发明专利技术涉及大豆基因编辑领域，具体涉及一种利用多基因编辑技术创制高

【技术实现步骤摘要】
利用多基因编辑技术创制高7S蛋白大豆和高11S蛋白大豆的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及大豆基因编辑领域，具体涉及一种利用多基因编辑技术创制高
7S
蛋白大豆和高
11S
蛋白大豆的方法及其应用
。

技术介绍

[0002]大豆蛋白的分类方法有很多种
。
根据蛋白质沉降系数为基础的超速离心分类法，大豆蛋白分为4个组分，既
2S、7S、11S
和
15S。
其中
2S
约占
22
％，主要是胰蛋白酶抑制因子和细胞色素
C
；
7S
约占大豆蛋白质的
37
％，是一个三聚体糖蛋白，主要包括大豆凝集素，
β
‑
淀粉酶
、
脂肪氧化酶和
β
‑
伴大豆球蛋白
(
β
‑
Conglycinin)
，其中
β
‑
伴大豆球蛋白由
α
、
α
’
和
β
三个亚基构成，是
7S
球蛋白的主要存在形式；
11S
约占大豆蛋白质的
31
％，主要为
11S
球蛋白
(Glycinin)
，其是一类不均质蛋白，是由
A
1a
B
1b
、A
1b
B2、A2B
1a
A3A4和
A5A4B3多个亚基组成的异源六聚体；
15S
约占大豆蛋白质的
10
％，是复合蛋白质，即多聚体球蛋白，其中包括脲酶
。
[0003]蛋白质的功能特性是影响食品系统中蛋白质行为的物理化学特性，涉及食品制备
、
加工和储存
。
这些特性是确定最终产品质量和促进其加工的重要手段
。
一般而言，大豆蛋白在提高许多加工性能方面具有巨大潜力，例如乳化
、
凝胶化
、
起泡
、
吸水和脂肪吸收，这些都是食品的公认属性
。
大豆蛋白的功能特性对改善食品结构和开发新产品具有重要作用
。
作为大豆蛋白中最丰富的贮藏蛋白，
7S
和
11S
球蛋白在影响大豆蛋白功能特性方面起着至关重要的作用
。
例如，通过大豆定向改良育种，对大豆
7S
和
11S
球蛋白的功能性进行定向修饰，可从源头上解决大豆抗原蛋白导致人和动物食用后引起的过敏反应，同时可减少加工企业的加工工序和降低生产成本，是彻底去除大豆抗原蛋白极好的解决办法
。
[0004]通过对不同大豆蛋白亚基变异种质的创制
、
明确不同大豆资源中
7S
与
11S
球蛋白含量及其比例对改良大豆蛋白的营养品质和加工品质具有重要意义
。
但是常规杂交育种的方式创制大豆球蛋白和
β
‑
伴大豆球蛋白完全缺失的种质资源费时费力，且易影响大豆其他农艺性状及品质；通过
RNAi
技术创制的大豆抗原蛋白亚基缺失突变体属于转基因植物范畴，存在一定的安全隐患
。
也有学者在大豆毛根系统中利用
CRISPR/Cas9
基因编辑技术对
7S
伴大豆球蛋白和
11S
球蛋白相关基因的定点突变的可行性进行了初探，但由于大豆稳定转化效率较低以及多基因编辑的困难性并未创制出
7S
伴大豆球蛋白和
11S
球蛋白相关基因全部缺失的新种质资源
。
因此，通过基因编辑技术定点精准突变目的基因对于快速实现大豆球蛋白和
β
‑
伴大豆球蛋白完全缺失的新种质资源创制具有深远的意义和极大的应用价值
。
[0005]专利技术简述
[0006]为解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种利用多基因编辑技术创制高
7S
蛋白大豆和高
11S
蛋白大豆的方法及其应用
。
[0007]本专利技术提供一种利用多基因编辑技术创制高
7S
蛋白大豆的方法，其包括以下步骤：
[0008]利用基因编辑方法采用单一载体或多个载体靶向多个基因位点来敲除大豆
Harbor
，
1989。
同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释
。
[0023]术语“基因编辑”是指针对活体有机体的任何遗传信息或基因组的靶向特异性修饰的策略和技术
。
因此，术语包括基因编码区的编辑，但也包括除基因组的基因编码区之外的区域的编辑
。
它还包括编辑或改造核
(
如果存在
)
以及细胞的其他遗传信息
。
[0024]术语“CRISPR/Cas
核酸酶”可以是基于
CRISPR
的核酸酶或编码其的核酸序列，包括但不限于：
1)Cas9
，包括
SpCas9
，
ScCas9
，
SaCas9
，
xCas9
，
VRER
‑
Cas9
，
EQR
‑
Cas9
，
SpG
‑
Cas9
，
SpRY
‑
Cas9
，
SpCas9
‑
NG
，
NG
‑
Cas9
，
NGA
‑
Cas9(VQR)
等，
2)Cas12
，包括
LbCpf1
，
FnCpf1
，
AsCpf1
，
MAD7
等，或前述基于
CRISPR
的核酸酶的任何变体或衍生物，优选其中所述至少一个基于
CRISPR
的核酸酶与相应的野生型序列相比包含突变，使得所获得的基于
CRISPR
的核酸酶识别不同的
PAM
序列
。
如本文所用，“基于
CRISPR
的核酸酶”是已经在天然存在的
CRISPR
系统中鉴定的任何核酸酶，其随后从其天然背景中分离，并且其优选已被修饰或组合成感兴趣的重组构建体，适合作为靶向基因组工程的工具
。
只要最初的基于野生型
CRISPR
的核酸酶提供
DNA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用多基因编辑技术创制高
7S
蛋白大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用基因编辑方法采用单一载体或多个载体靶向多个基因位点来敲除大豆
Glyma.13g123500、Glyma.10g037100、Glyma.19g164900、Glyma.03g163500
和
Glyma.19g164800
基因，获得大豆
11S
球蛋白的
A
亚基和
B
亚基全部缺失的新种质
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑方法采用
CRISPR/Cas
核酸酶系统，优选
Cas9
核酸酶系统或
Cas12
核酸酶系统
。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单一载体或多个载体中包含多个
sgRNA
或
crRNA
，所述
sgRNA
或
crRNA
分别靶向所述基因；优选地，包含至少3个
sgRNA
或
crRNA
，分别靶向
Glyma.19g164800、
同源基因
Glyma.13g123500
和
Glyma.10g037100、
同源基因
Glyma.19g164900
和
Glyma.03g163500。4.
根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单一载体或多个载体中包含3个
sgRNA
或
crRNA
，其对应的大豆基因组序列分别为
5'CAAGAAGAAGAAAACGAAGG3'
，
5'ACTCAACAACCTCAACGCGT3'
和
5'TTGAAGAGCCACAACGGGAG3'
及其互补序列
。5.
一种利用多基因编辑技术创制高
11S
蛋白大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用
CRISPR/Cas9
基因编辑方法采用单一载体或多个载体靶向多个基因位点来敲除大豆
Glyma.20G148400、Glyma.10G246300、Glyma.20G148300、Glyma.10G246500、Glyma.20G146300、Glyma.20G148200
和
Glyma.20G146200
基因，获得大豆
7S
β
‑
伴...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：青岛清原种子科学有限公司，
类型：发明
国别省市：