植物调控元件及其用途制造技术

本发明专利技术提供了新型合成小核

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】植物调控元件及其用途
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求于
2021
年4月
30
日提交的美国临时申请第
63/182,288
号和于
2021
年
12
月
30
日提交的美国临时申请第
63/295,061
号的权益，所有这些临时申请整体以引用方式并入本文
。
[0003]序列表的并入
[0004]37
千字节
(
如在
Microsoft
中测量的
)
并且在
2022
年4月
28
日创建的含于名为“MONS492WO
‑
sequence_listing”的文件中的序列表通过电子递交在此提交并且以引用方式并入本文
。


[0005]本公开涉及生物

。
更具体地，本公开提供了新型合成植物启动子，其有益于表达例如用于
CRISPR
介导的基因组修饰的非蛋白编码小
RNA。

技术介绍

[0006]位点特异性重组具有应用于广泛的生物技术相关领域的潜力
。
含有
DNA
结合结构域和
DNA
裂解结构域的大范围核酸酶
、
锌指核酸酶
(ZFN)
和转录激活物样效应物核酸酶
(TALEN)
能够进行基因组修饰
。
虽然大范围核酸酶
、ZFN
和
TALEN
是有效的和特异性的，但是这些技术需要通过对选择用于修饰的每个基因组位点的一种或多种组分进行蛋白质工程化来产生
。
应用成簇的规则间隔的短回文重复序列
CRISPR
的进展已经说明了具有快速工程化的优点的基因组修饰方法
。
[0007]成簇的规则间隔的短回文重复序列
(CRISPR)
系统构成原核生物中靶向侵入噬菌体的核酸内切裂解的适应性免疫系统
。
所述系统由蛋白质组分
(Cas)
和指导
RNA(gRNA)
组成，所述指导
RNA
将
Cas
蛋白质靶向特定基因座以用于核酸内切裂解
。
此系统已经成功地工程化以靶向用于哺乳动物
、
斑马鱼
、
果蝇
、
线虫
、
细菌
、
酵母和植物基因组的核酸内切裂解的特定基因座
。
[0008]优选编码指导
RNA
的
DNA
序列由转录小核
RNA(snRNA)
的
RNA
聚合酶
III
转录
。
天然启动子
(
诸如
U6 snRNA
启动子
)
通常用于驱动
gRNA
的表达
。
多重靶向实验通常依赖于驱动每个
gRNA
的相同启动子
。
当克隆或维持包含多个
U6/gRNA
盒的质粒时，这可能导致技术问题，诸如重组事件或由盒中的序列冗余引起的缺失
。
使多个
snRNA
启动子具有不同的
DNA
序列将有助于缓解这个技术问题
。
因此，本专利技术人在此公开了与已知的天然
U6 snRNA
启动子和彼此几乎没有序列同源性的新型合成的
snRNA
启动子
。
这些新型合成
snRNA
启动子能够驱动
RNA
聚合酶
III
转录物
(
诸如
gRNA)
在植物细胞中的表达
。

技术实现思路

[0009]在一个方面，本专利技术提供了合成小核
RNA(snRNA)
启动子，其包含选自由以下组成的组的
DNA
序列：
(a)
与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个具有至少
85
％序列同一性的序列；
(b)
包
含
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的序列；和
(c)SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的片段
。
在一个实施方案中，所述合成
snRNA
启动子序列与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的
DNA
序列具有至少
90
％的序列同一性
。
在另一个实施方案中，所述合成
snRNA
启动子序列与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的
DNA
序列具有至少
95
％序列同一性
。
在又另一个实施方案中，所述合成
snRNA
启动子片段包含基因调控活性
。
[0010]本专利技术的另一个方面提供了重组
DNA
构建体，其包含合成
snRNA
启动子，所述合成
snRNA
启动子可操作地连接至编码一种或多种指导
RNA(gRNA)
的
DNA
序列，其中所述合成
snRNA
启动子的序列选自由以下组成的组：
(a)
与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个具有至少
85
％序列同一性的序列；
(b)
包含
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的序列；和
(c)SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的片段，其中所述合成
snRNA
启动子能够表达
gRNA。
在一些实施方案中，所述重组
DNA
构建体还包含转录终止序列
。
在一些实施方案中，所述重组
DNA
构建体还可以进一步包含编码启动子的
DNA
序列，所述
DNA
序列可操作地连接至编码成簇的规则间隔的短回文重复序列
CRISPR
相关蛋白的
DNA
序列
。
在一些实施方案中，所述
CRISPR
相关蛋白选自
I
型
CRISPR
相关蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种合成小核
RNA(snRNA)
启动子，其包含选自由以下组成的组的
DNA
序列：
a.
与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个具有至少
85
％序列同一性的序列；
b.
包含
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的序列；以及
c.SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的片段
。2.
如权利要求1所述的合成
snRNA
启动子，其中所述序列与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的
DNA
序列具有至少
90
％序列同一性
。3.
如权利要求1所述的合成
snRNA
启动子，其中所述序列与
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个的
DNA
序列具有至少
95
％序列同一性
。4.
如权利要求1所述的合成
snRNA
启动子，其中所述片段包含基因调控活性
。5.
一种重组
DNA
构建体，其包含合成
snRNA
启动子，所述合成
snRNA
启动子可操作地连接至编码指导
RNA(gRNA)
的
DNA
序列，其中所述合成
snRNA
启动子的序列是
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个或其片段，其中所述片段包含基因调控活性
。6.
如权利要求5所述的重组
DNA
构建体，其还包含转录终止序列
。7.
如权利要求5所述的重组
DNA
构建体，其还包含编码启动子的
DNA
序列，所述
DNA
序列可操作地连接至
I
型
CRISPR
相关蛋白
、II
型
CRISPR
相关蛋白
、III
型
CRISPR
相关蛋白
、IV
型
CRISPR
相关蛋白
、V
型
CRISPR
相关蛋白或
VI
型
CRISPR
相关蛋白
。8.
如权利要求7所述的重组
DNA
构建体，其中
CRISPR
相关蛋白进一步可操作地连接至至少一个核定位序列
(NLS)。9.
如权利要求7所述的重组
DNA
构建体，其中所述
CRISPR
相关蛋白选自由以下组成的组：
Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas 12a、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY
和
Mad7。10.
一种重组
DNA
构建体，其包含合成
snRNA
启动子，所述合成
snRNA
启动子可操作地连接至指定非编码
RNA
的序列，其中所述合成
snRNA
启动子的序列是
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个或其片段，其中所述片段包含基因调控活性
。11.
如权利要求
10
所述的重组
DNA
构建体，其中所述非编码
RNA
选自由以下组成的组：指导
RNA(gRNA)、
单指导
RNA(sgRNA)、crRNA、
前
crRNA、tracrRNA、PEgRNA、
微小
RNA(miRNA)、miRNA
前体
、
小干扰
RNA(siRNA)、
小
RNA(
长度
22
‑
26nt)
和编码其的前体
、
异染色质
siRNA(hc
‑
siRNA)、Piwi
‑
相互作用
RNA(piRNA)、
发夹双链
RNA(
发夹
dsRNA)、
反式作用
siRNA(ta
‑
siRNA)
和天然存在的反义
siRNA(nat
‑
siRNA)。12.
一种重组
DNA
构建体，其包含至少第一表达盒，所述第一表达盒包含合成
snRNA
启动子，所述合成
snRNA
启动子可操作地连接至编码指导
RNA(gRNA)
的
DNA
序列，其中所述启动子的序列包含
SEQ ID NO:1
‑
10
中的任一个或其片段，其中所述片段包含基因调控活性
。13.
如权利要求
12
所述的重组
DNA
构建体，其还包含至少第二表达盒，其中编码第一
gRNA
的序列不同于编码第二
gRNA
的序列
。14.
如权利要求
13
所述的重组
DNA
构建体，其中可操作地连接至所述编码第一
gRNA
的序列的所述合成
snRNA
启动子不同于可操作地连接至所述编码第二
gRNA
的序列的所述合成
snRNA
启动子
。
15.
如权利要求
14
所述的构建体，其包含各自长度为约
200
‑
1200bp
的侧翼左同源臂和右同源臂
(HA)。16.
如权利要求
15
所述的构建体，其中所述同源臂长约
230
至
...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：