一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系及其构建方法和应用，对

【技术实现步骤摘要】
一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及程序性细胞坏死检测体系的构建，具体涉及一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系及其构建方法和应用
。
属于小分子荧光探针和生物检测

。

技术介绍

[0002]程序性细胞坏死
(Necroptosis)
是一种受调节的程序性细胞死亡形式，依赖于受体相互作用蛋白激酶
1(Receptor
‑
interacting protein kinase 1
，
RIPK1)、
受体相互作用蛋白激酶
3(Receptor
‑
interactingprotein kinase 3
，
RIPK3)
和底物混合谱系激酶样蛋白
(Mixed Lineage Kinase Domain
‑
Like
，
MLKL)。
在程序性细胞坏死过程中
MLKL<br/>作为关键执行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于双分子荧光互补技术的融合基因组合，其特征在于，包含以下两个融合基因：
(A)
融合基因1，即“HA
‑
MLKL
‑
VC”融合基因，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
(B)
融合基因2，即“Flag
‑
MLKL
‑
VN”融合基因，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
根据权利要求1所述的融合基因组合，其特征在于，所述融合基因1是由
MLKL
开放阅读框和
VC
顺次连接组成，其中
MLKL
的
N
端连接
HA
标签蛋白，
MLKL
的
C
端连接
VC
片段，然后再在
VC
片段的
C
端连上
HA
标签蛋白；所述的
VC
为
Venus
荧光蛋白
C
端，即氨基酸
155
‑
238。3.
根据权利要求1所述的融合基因组合，其特征在于，所述融合基因2是由
MLKL
开放阅读框和
VN
顺次连接组成，其中
MLKL
的
C
端和
VN
中间插入一段
Flag
标签序列“5
‑
GATTACAAGGACGACGATGACAAG
‑
3”作为连接肽，并且，
MLKL
的
N
端连接
Flag
标签蛋白；所述的
VN
为
Venus
荧光蛋白
N
端，即氨基酸1‑
154。4.
权利要求1～3中任一项所述融合基因组合编码的融合蛋白组合，包含以下两个融合蛋白：
(a)
融合基因1编码的融合蛋白，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；
(b)
融合基因2编码的融合蛋白，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。5.
一种检测程序性细胞坏死的双分子荧光片段互补体系，其特征在于，是将权利要求1～3中任一项所述融合基因组合中两个融合基因分别独立连入哺乳动物表达载体
、
转染细胞，从而构建得到
。6.
权利要求5所述双分子荧光片段互补体系的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)
将前述融合基因组合中的融合基因
1、
融合基因2通过酶切分别连接至
pLVX
‑
Hygromycin
和
pLVX
‑
puro
慢病毒载体，转化至感受态细胞后筛选鉴定；
(2)
使用脂质体介导的
Lipo293
TM
转染试剂将构建成功的慢病毒载体转染入
HEK293T
细胞，得到
pLVX
‑
Hygromycin
‑
融合基因1和
pLVX
‑
puro
‑
融合基因2；
(3)
建立荧光蛋白互补体系并检测其发光活性
。7.
根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤
(1)
中，融合基因1所使用的载体为
pLVX
‑
Hygromycin
载体，酶切位点为

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡振宇，宋倩倩，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：