一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，通过对设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物

【技术实现步骤摘要】
一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物鉴定
，尤其涉及一种用于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法
。

技术介绍

[0002]在枸杞属分类群中，宁夏枸杞和黑果枸杞为国内商业栽培利用最广泛的两种，经济价值最大
。
通过研究发现，二者的部分野生群体有着不同程度的杂交现象，杂交子代在表型性状上和两个亲本有不同程度的相似性，但是由于杂交子代存在着果实较小，经济性状差的现象，因此在人工栽培中需要在苗期进行筛选和鉴定
。
[0003]SSR
分子标记也叫微卫星，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，通常是一种用1‑6个寡核苷酸组成的简单重复序列，其两端是保守的单拷贝序列，常用的手段是在序列的两端设计并连接一对特异性引物
。SSR
标记具有共显性的特点，大多数情况下微卫星在生物的基因组中分布，变异位点中包含很多遗传基因，这样的标记方法多态性稳定且重复率高，操作便利，灵敏度好
。
由于重复单位的重复次数在个体间高度变异，数量丰富，因此微卫星标记有广泛的应用性
。
利用
SSR
标记的方法可以对品种和种群之间的多样性进行评价的研究，也可以应用到遗传图谱的构建和种质的鉴定等方面
。
但目前该方法并未应用于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种鉴定，对于黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定大多还是凭借个人经验进行判断，这导致准确性不高
。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术的缺点，提供一种针对黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法
。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：
[0006]1、SSR
数据的获得和引物的设计：
[0007]设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物
、
黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞
、
杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个
DNA
样品对选取的引物进行
PCR
扩增；
[0008]通过对引物长度
、
产物长度以及
Tm
值的额对比分析，对引物进行合成；
[0009]2、
引物的验证：
[0010]2.1、
叶片
DNA
提取
[0011]通过改进的
CTAB
法提取和纯化枸杞叶片基因组
DNA
，用
1.5
％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组
DNA
的完整性；
[0012]2.2、
扩增体系构建
[0013]根据紫外光谱分析法，紫外分光光度计测定
DNA
模板的浓度和质量，用时将模板浓度稀释至
20
‑
40ng/
μ
L
；经测定，模板浓度约为
100ng/
μ
L
，
A260/A280
为
1.7
‑
2.0
，以满足
SSR
对
模板质量的要求；
[0014]经过对复性温度和延伸温度与时间的梯度
PCR
，确定最终的
SSR
‑
PCR
反应程序：
(1)95℃
预变性
5min
；
(2)94℃
变性
30s
；
(3)54℃
退火
45s
；
(4)72℃
延伸
1min
；
(5)
步骤
(2)
‑
(4)
共循环
40
次；
(6)72℃
延伸
7min
；
(7)4℃
保存；
[0015]选取合成的引物以及
DNA
模板进行体系筛选；
[0016]2.3、
引物筛选
[0017]利用选择的
PCR
体系对生物合成的引物进行筛选，进而对若干若干个单株样本进行扩增；选择模板
DNA
对所有引物进行筛选，最终得到若干对特异性良好的引物；
[0018]3、
基于
SSR
进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种的检测：
[0019]将筛选出的引物分别用若干个模板
DNA
进行
SSR
分子标记，记录扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；
[0020]4、
利用软件
STRUCTURE 2.3
进行纯种和杂交种的鉴定
[0021]分析时不作数迭代设置为
10000,
不作数迭代后的
MCMC
设置为
100000
；设定不同的划分群体数目，即
K
值，为确定合适的类群数目，
K
取值从2到8，
X
是基因型，对多为点基因型数据进行对数运算，即
lnP(X|K)
，用来确定
K
值；
[0022]每一
K
值下运算若干次，用于计算
Δ
K
，
Δ
K
的计算是基于相邻
K
值的
lnP(X|K)
的差值
,
即
Δ
K
＝
m|L(K+1)
‑
2L(K)+L(K)|/s|L(K)|
，依据
lnP(X|K)
和
Δ
K
的值确定合适的
K
值；在混合模型中，根据后验概率估算每一样品的基因来源及其比例，根据混合系数
Q
来判定纯合体和杂合体，
Q
的阈值为
0.9
；
[0023]5、
种群数目
K
值的判断
[0024]在不输入任何物种信息的条件下，利用软件
STRUCTURE 2.3.1
对各样品的
SSR
数据进行遗传结构及模型聚类分析；对
Δ
K
进行计算，峰值在
K
＝3时出现，
Δ
K
＝
1.977
，且远大于
K
＝5时的值
0.731
，而
K
＞3时，
Δ
K
的值更小，均小于1；
[0025]6、
获取杂交情况
[0026]根据
STRUCTURE
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种黑果枸杞和宁夏枸杞杂交种的鉴定方法，其特征在于：按以下步骤进行：
1、SSR
数据的获得和引物的设计：设计若干对微卫星引物进行筛选，包括数量相同的黑果枸杞引物
、
黄果枸杞引物及宁夏枸杞引物，然后再分别选择黑果枸杞
、
杂交带枸杞和宁夏枸杞若干个
DNA
样品对选取的引物进行
PCR
扩增；通过对引物长度
、
产物长度以及
Tm
值的额对比分析，对引物进行合成；
2、
引物的验证：
2.1、
叶片
DNA
提取通过改进的
CTAB
法提取和纯化枸杞叶片基因组
DNA
，用
1.5
％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组
DNA
的完整性；
2.2、
扩增体系构建根据紫外光谱分析法，紫外分光光度计测定
DNA
模板的浓度和质量，用时将模板浓度稀释至
20
‑
40ng/
μ
L
；经测定，模板浓度约为
100ng/
μ
L
，
A260/A280
为
1.7
‑
2.0
，以满足
SSR
对模板质量的要求；经过对复性温度和延伸温度与时间的梯度
PCR
，确定最终的
SSR
‑
PCR
反应程序：
(1)95℃
预变性
5min
；
(2)94℃
变性
30s
；
(3)54℃
退火
45s
；
(4)72℃
延伸
1min
；
(5)
步骤
(2)
‑
(4)
共循环
40
次；
(6)72℃
延伸
7min
；
(7)4℃
保存；选取合成的引物以及
DNA
模板进行体系筛选；
2.3、
引物筛选利用选择的
PCR
体系对生物合成的引物进行筛选，进而对若干若干个单株样本进行扩增；选择模板
DNA
对所有引物进行筛选，最终得到若干对特异性良好的引物；
3、
基于
SSR
进行黑果枸杞与宁夏枸杞杂交种的检测：将筛选出的引物分别用若干个模板
DNA
进行
SSR
分子标记，记录扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；
4、
利用软件
STRUCTURE 2.3
进行纯种和杂交种的鉴定分析时不作数迭代设置为
10000,
不作数迭代后的
MCMC
设置为
100000
；设定不同的划分群体数目，即
K
值，为确定合适的类群数目，
K
取值从2到8，
X
是基因型，对多为点基因型数据进行对数运算，即
lnP(X|K)
，用来确定
K
值；每一
K
值下运算若干次，用于计算
Δ
K
，
Δ
K
的计算是基于相邻
K
值的
lnP(X|K)
的差值
,
即
Δ
K
＝
m|L(K+1)
‑
2L(K)+L(K)|/s|L(K)|
，依据
lnP(X|K)
和
Δ
K
的值确定合适的
K
值；在混合模型中，根据后验概率估算每一样品的基因来源及其比例，根据混合系数
Q
来判定纯合体和杂合体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张得芳，唐昊，史文君，刘晓雯，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：