仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法及应用

【技术实现步骤摘要】
仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及农业害虫抗药性检测技术，具体地说，涉及仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法及应用
。

技术介绍

[0002]仓储害虫在粮食储藏运输阶段高发，会降低农作物的产量和质量，也有可能间接的传播病害，造成粮食损失，严重威胁粮食安全
。
在仓储害虫的治理过程中，化学防治是杀灭害虫的经济有效手段之一，主要应用的熏蒸剂有溴甲烷和磷化氢
(
王殿轩等，
2004)。
但溴甲烷因对大气臭氧层具有破坏作用而被淘汰，磷化氢因具有渗透力强
、
杀虫谱广
、
使用便捷
、
挥发迅速
、
残留量低等独特的优点成为全世界广泛使用的储粮熏蒸剂
。
目前磷化氢
(PH3)
熏蒸作为防治仓储害虫的主要手段，已在世界范围内应用近
60
年
(FIELDS P G et al.,2002)。
[0003]随着磷化氢作为化学熏蒸剂使用时间的增长，出现了长期单一用药和不科学使用等问题，导致世界范围内主要储粮害虫抗药性问题日益严重
(
严晓平等，
2004
；郭道林等，
2004
；唐培安等，
2006)。
如今磷化氢抗性在全球范围内高发，如澳大利亚谷物昆虫抗性数据库显示：自
1997
年首次在赤拟谷盗中发现磷化氢强耐药性以来，抗性一直呈上升趋势，在澳大利亚多个地区的锈赤扁谷盗的磷化氢抗性倍数均达到
400
倍以上
(Nayak M K et al.,2013
；
Nayak M K et al.,2017)
；在北美俄克拉荷马州的调查显示，在过去
20
年间，赤拟谷盗的耐药性频率显著增加，从美国不同地区收集的赤拟谷盗中发现有磷化氢抗性倍数达
127
倍的种群
(G.P.Opit et al.,2012
；
Cato A J etal.,2017)
；而在我国福建
、
海南
、
山东
、
广东
、
湖南等多个地区收集到的赤拟谷盗
、
锈赤扁谷盗和谷蠹对磷化氢均有抗性，最高抗性可达
1173.6
倍
(
程宏等，
2020
；孟宏杰等，
2020)。
因此当前需要在明确害虫抗性水平的基础上，采取针对性的控制技术
。
[0004]当前仓储害虫的磷化氢抗性检测技术存在不足，急需开发更加快速精准的抗性检测技术，已有抗性检测技术如下：
[0005](1)FAO
的熏蒸方法
[0006]FAO
方法被广泛用于测定储粮害虫是否存在
PH3抗性以及抗性害的抗性倍数，主要是测定害虫在不同浓度
PH3中
20
小时的死亡率
。
但用
FAO
方法测定高抗性品系时必须用高
PH3浓度，而高
PH3浓度
(2mg/L
以上
)
易引起害虫自身保护性昏迷，影响害虫死亡率记录的准确性
。FAO
方法虽然较为准确，但需要处理
20
小时和数十头昆虫，且操作复杂
、
等待时间长不能满足基层粮库实际应用需要
(FAO,1975
；曹阳，
2006)。
[0007](2)
击倒法
[0008]将
10
头储粮害虫成虫放入一定容积的密封击倒熏蒸瓶内，用气密性注射器向瓶内注入一定体积的已知浓度磷化氢气体，使熏蒸瓶内的磷化氢浓度达到一定浓度，后观察供试成虫的反应，当成虫出现痉挛症状时，认为该成虫被磷化氢击倒，即出现麻痹反应
。
研究发现利用害虫被磷化氢击倒时间的长和短，可快速定性判断害虫磷化氢抗性程度
(
曹阳和
王殿轩，
2002)。
击倒法虽然可以较为准确且快速检测试虫磷化氢抗性，但仍然需要
10
头左右昆虫，且需开展磷化氢熏蒸，对操作要求较高，结果也受主观人为判断影响较大
。
[0009](3)
基于抗性基因的分子检测方法
[0010]研究表明储粮害虫磷化氢高抗种群的发生是由于
rph1
和
rph2
基因突变的协同作用
。Schlipalius
等
(2012)
以该基因的点突变作为依据，开发出一种能够检测磷化氢抗性储粮害虫的方法
。
抗性基因分子检测虽然快速，样本量小，但是只能检测基因位点是否突变，不能准确检测品系的具体抗性水平
。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的是提供仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法及应用
。
[0012]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法，包括以下步骤：
[0013](1)
以某种特定的仓储害虫作为研究对象，采用联合国粮农组织
(FAO)
推荐的磷化氢
(PH3)
抗药性测定方法，对来自于不同地区的该仓储害虫种群进行磷化氢抗性检测，根据抗性检测结果，将不同种群划分为敏感
、
中抗和高抗品系；
[0014](2)
利用固相微萃取
‑
气质联用法
(GC
‑
MS)
，分别检测敏感
、
中抗和高抗品系的表达代谢物，从不同品系的差异性表达代谢物中筛选出磷化氢抗性相关特征代谢标志物
。
[0015]所述仓储害虫包括但不限于赤拟谷盗
。
[0016]进一步地，步骤
(2)
中固相微萃取包括：
[0017]1)
将
30
只具有活力的赤拟谷盗，放入
2mL
微管中
(Eppendorf
，德国
)
，将微管立即用液氮冷冻，并在
‑
80℃
超低温冰箱
(MDF
‑
U73V,Sanyo Electric Co.Ltd,
日本
)
中保存
。
将虫体在微管中研磨成粉末，然后立即注入
1.5mL HPLC
级乙腈
(≥99.9
％，西龙化工股份有限公司，中国
)
中，使用振荡器
(IKA MS 3basic,IKA,
德国
)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
仓储害虫磷化氢抗性相关特征代谢标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
以某种特定的仓储害虫作为研究对象，采用联合国粮农组织推荐的磷化氢抗药性测定方法，对该仓储害虫不同种群进行磷化氢抗性检测，根据抗性检测结果，将不同种群划分为敏感
、
中抗和高抗品系；
(2)
利用固相微萃取
‑
气质联用法，分别检测敏感
、
中抗和高抗品系的表达代谢物，从不同品系的差异性表达代谢物中筛选出磷化氢抗性相关特征代谢标志物
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述仓储害虫为赤拟谷盗
。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
中固相微萃取包括：
1)
将1‑
30
只具有活力的赤拟谷盗，放入微管中，将微管立即用液氮冷冻，并在
‑
80℃
超低温冰箱中保存，将虫体在微管中研磨成粉末，然后立即注入
1.5mL HPLC
级乙腈中，使用振荡器将微管震荡
3min
，转速
1000rpm
；然后用离心机在
25℃、4000rpm
条件下离心
3min
；取上清，转移到色谱瓶中；
2)
将
SPME
萃取头插入上清样品中，在
25
±
1℃
条件下提取
1h
；提取完成后将
SPME
萃取头直接注入
GC
‑
MS
进样口，在进样温度
270℃
条件下解吸
15min
，分析样品
。4.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
中采用
Agilent 8890
气相色谱仪，色谱柱为
HP
‑
5MS
毛细管柱，
30m
×
0.25mm,0.25
μ
m
，以及
5977B
质量检测器；载气为
99.999
％纯化的氦气，流速为
1ml/min
；气相色谱条件为：进样口温度
270℃
；柱箱初始温度是
60℃
，维持
2min
，然后以
7℃/min
的速率升温至
200℃
，接着以
5℃/min
的速率升至
300℃
，最后以
50℃/min
的速率升温至
320℃
并保持
3min
；质谱条件为：离子源的输电线路温度为
230℃
；
MSD
的传输线温度是
280℃
；四极的温度为

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，刘群，李丽，单常尧，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：