一种三叶青组织培养快速繁殖的方法技术

本发明专利技术涉及组织培养技术领域，具体涉及一种三叶青组织培养快速繁殖的方法

【技术实现步骤摘要】
一种三叶青组织培养快速繁殖的方法


[0001]本专利技术涉及组织培养
，具体涉及一种三叶青组织培养快速繁殖的方法
。

技术介绍

[0002]三叶青又名有角乌蔹莓
、
石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，三叶青在临床上已逐步用于肝癌
、
肺癌
、
白血病与艾滋病等疾病的治疗，被称为安全无毒的“植物青霉素”。
但是由于人为过度采挖三叶青，加上三叶青对生长环境要求苛刻，三叶青野生资源锐减，已处于濒危状态，同时随着三叶青药用成分更深入的研究与开发，使其野生三叶青远远满足不了市场逐年递增的需求，而利用组织培养技术快速增殖瓶苗，可以在短时期内提供大量种苗
。
[0003]目前已报道的三叶青组织快繁体系中外植体选择
、
灭菌方式
、
培养基配方和预期效果等都各不相同，现有的常规灭菌方式灭菌后的外植体内依旧会含有部分细菌，存在灭菌不彻底不充分的问题，从而导致带菌的外植体在培养过程中会污染培养基，影响培养效果，并且常规使用的培养基存在增殖系数较低，生根率低的问题，并且会使培养后的种苗存活率较低
。
[0004]为解决上述工艺难点，本专利技术研究在提高外植体的灭菌效果，降低培养基污染率的同时提高三叶青丛生芽的增殖系数及生根率的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法
。

技术实现思路

[0005]为解决上述工艺难点，本专利技术研究在提高外植体的灭菌效果，降低培养基污染率的同时提高三叶青丛生芽的增殖系数及生根率的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法
。
[0006]一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，具体包括以下步骤：
[0007]S1
：外植体的选择及灭菌处理
[0008]采摘无灾无害的三叶青腋芽茎段，清洗干净后先对其进行初步消毒后在对其进行深层消毒灭菌得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段，将灭菌消毒后的外植体腋芽茎段吸干水分后切段，每段保证含1个腋芽；
[0009]S2
：抗菌剂的制备
[0010]对纳米氧化锌进行改性后，将改性后的纳米氧化锌
、
壳聚糖和茶多酚磁力搅拌得到抗菌剂；
[0011]S3
：改良诱导培养基及诱导培养
[0012]以
MS
培养基为基本培养基，向
MS
基本培养基内加入6‑
BA
，琼脂，蔗糖，和抗菌剂，混合均匀灭菌得到改良诱导培养基，将切成小段的外植体腋芽茎段接种到培养基上培养得到诱导培养后的新芽；
[0013]S4
：改良增殖培养基及增殖培养
[0014]取新鲜香蕉和马铃薯放入破碎机内，再加入椰汁破碎，破碎物内加入活性炭粉末，超声辅助下混合搅拌均匀，得到混合物，以
MS
培养基为基本培养基，向
MS
基本培养基内加入
BA
，
NAA
，
PVP
和混合物，混合均匀灭菌得到改良增殖培养基，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，接种到增殖培养基上培养得到增殖后的三叶青丛生芽；
[0015]S5
：改良生根培养基及生根培养
[0016]取活性炭颗粒研磨粉碎过筛后得到活性炭粉末，向活性炭粉末内加入蔗糖和纳米二氧化硅混合搅拌均匀，得到混合物，以
1/2MS
培养基为基本培养基，向
1/2MS
基本培养基内加入
IBA
，
NAA
和混合物，混合均匀灭菌得到改良生根培养基，将丛生芽接种到生根培养基上培养得到已生根的三叶青植株；
[0017]S6
：三叶青苗的移栽
[0018]将已生根的三叶青植株培养基在自然环境下放置一段时间后，将放置好的三叶青植株苗取出，将三叶青植株基部清洗干净后，将三叶青植株苗移栽到珍珠岩与泥炭土混合基质上培养一段时候后移栽到大田内即可
。
[0019]进一步地，步骤
S1
外植体的选择及灭菌处理，具体包括以下步骤：
[0020]S1.1
：采摘无病虫害
、
无病菌侵染的生长健壮的
10
‑
20
株三叶青腋芽茎段，带回备用；
[0021]S1.2
：将带回的腋芽茎段用洗洁精清洗干净，在流水下冲洗
20
‑
30min
，使用无菌水清洗2‑3次后，放置在1‑
2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠溶液内清洗5‑
10min
，再用无菌水浸泡
10
‑
20min
，晾干
、
紫外灭菌
20
‑
30min
，得到初步灭菌的腋芽茎段；
[0022]S1.3
：将初步灭菌的腋芽茎段放置在
70
‑
75
％乙醇溶液内，浸泡
10
‑
15s
，用无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入2‑3％的次氯酸钠溶液中消毒
15
‑
20min
，无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入
0.1
‑
0.2
％氯化汞溶液内，并加入2～3滴吐温，灭菌处理6‑
10min
，无菌水冲洗2‑3次，最后放置到8‑
10
％双氧水内震荡消毒
50
‑
60s
后，用无菌水清洗干净，得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段；
[0023]S1.4
：将消毒后的外植体腋芽茎段用无菌手术刀切除两端，并用无菌滤纸吸干水分，再用无菌的解剖刀
、
镊子将其切成小段，每段保证含1个腋芽，备用
。
[0024]进一步地，步骤
S2
抗菌剂的制备，具体包括以下步骤：
[0025]S2.1
：取
10
‑
20
重量份无水乙醇，加入2‑4重量份纳米氧化锌，超声分散
10
‑
20min
，向分散液内加入
0.1
‑
0.2
重量份山梨酸，
50
‑
60℃
下水浴加热
10
‑
20min
，离心取沉淀，将沉淀物在
50
‑
60℃
下真空干燥
10
‑
12h
，得到改性纳米氧化锌；
[0026]S2.2
：取2‑4重量份改性纳米氧化锌，加入5‑8重量份壳聚糖和1‑2重量份茶多酚，磁力搅拌
10
‑
20min
，得到抗菌剂
。
[0027]进一步地，步骤
S3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1
：外植体的选择及灭菌处理采摘无灾无害的三叶青腋芽茎段，清洗干净后先对其进行初步消毒后在对其进行深层消毒灭菌得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段，将灭菌消毒后的外植体腋芽茎段吸干水分后切段，每段保证含1个腋芽；
S2
：抗菌剂的制备对纳米氧化锌进行改性后，将改性后的纳米氧化锌
、
壳聚糖和茶多酚磁力搅拌得到抗菌剂；
S3
：改良诱导培养基及诱导培养以
MS
培养基为基本培养基，向
MS
基本培养基内加入6‑
BA
，琼脂，蔗糖，和抗菌剂，混合均匀灭菌得到改良诱导培养基，将切成小段的外植体腋芽茎段接种到培养基上培养得到诱导培养后的新芽；
S4
：改良增殖培养基及增殖培养取新鲜香蕉和马铃薯放入破碎机内，再加入椰汁破碎，破碎物内加入活性炭粉末，超声辅助下混合搅拌均匀，得到混合物，以
MS
培养基为基本培养基，向
MS
基本培养基内加入
BA
，
NAA
，
PVP
和混合物，混合均匀灭菌得到改良增殖培养基，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，接种到增殖培养基上培养得到增殖后的三叶青丛生芽；
S5
：改良生根培养基及生根培养取活性炭颗粒研磨粉碎过筛后得到活性炭粉末，向活性炭粉末内加入蔗糖和纳米二氧化硅混合搅拌均匀，得到混合物，以
1/2MS
培养基为基本培养基，向
1/2MS
基本培养基内加入
IBA
，
NAA
和混合物，混合均匀灭菌得到改良生根培养基，将丛生芽接种到生根培养基上培养得到已生根的三叶青植株；
S6
：三叶青苗的移栽将已生根的三叶青植株培养基在自然环境下放置一段时间后，将放置好的三叶青植株苗取出，将三叶青植株基部清洗干净后，将三叶青植株苗移栽到珍珠岩与泥炭土混合基质上培养一段时候后移栽到大田内即可
。2.
根据权利要求1所述的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，步骤
S1
外植体的选择及灭菌处理，具体包括以下步骤：
S1.1
：采摘无病虫害
、
无病菌侵染的生长健壮的
10
‑
20
株三叶青腋芽茎段，带回备用；
S1.2
：将带回的腋芽茎段用洗洁精清洗干净，在流水下冲洗
20
‑
30min
，使用无菌水清洗2‑3次后，放置在1‑
2mmol/L
乙二胺四乙酸二钠溶液内清洗5‑
10min
，再用无菌水浸泡
10
‑
20min
，晾干
、
紫外灭菌
20
‑
30min
，得到初步灭菌的腋芽茎段；
S1.3
：将初步灭菌的腋芽茎段放置在
70
‑
75
％乙醇溶液内，浸泡
10
‑
15s
，用无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入2‑3％的次氯酸钠溶液中消毒
15
‑
20min
，无菌水冲洗干净后，将腋芽茎段放入
0.1
‑
0.2
％氯化汞溶液内，并加入2～3滴吐温，灭菌处理6‑
10min
，无菌水冲洗2‑3次，最后放置到8‑
10
％双氧水内震荡消毒
50
‑
60s
后，用无菌水清洗干净，得到灭菌消毒后的外植体腋芽茎段；
S1.4
：将消毒后的外植体腋芽茎段用无菌手术刀切除两端，并用无菌滤纸吸干水分，再用无菌的解剖刀
、
镊子将其切成小段，每段保证含1个腋芽，备用
。
3.
根据权利要求1所述的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，步骤
S2
抗菌剂的制备，具体包括以下步骤：
S2.1
：取
10
‑
20
重量份无水乙醇，加入2‑4重量份纳米氧化锌，超声分散
10
‑
20min
，向分散液内加入
0.1
‑
0.2
重量份山梨酸，
50
‑
60℃
下水浴加热
10
‑
20min
，离心取沉淀，将沉淀物在
50
‑
60℃
下真空干燥
10
‑
12h
，得到改性纳米氧化锌；
S2.2
：取2‑4重量份改性纳米氧化锌，加入5‑8重量份壳聚糖和1‑2重量份茶多酚，磁力搅拌
10
‑
20min
，得到抗菌剂
。4.
根据权利要求1所述的一种三叶青组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，步骤
S3
改良诱导培养基及诱导培养，具体包括以下步骤：
S3.1
：以
MS
培养基为基本培养基，向
MS
基本培养基内加入
0.5
‑
1.0mg/L6
‑
BA
，7‑
8g/L
琼脂，
25
‑
30g/L
蔗糖，
0.1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张加强，朱开元，刘慧春，史小华，许雯婷，李文略，
申请(专利权)人：浙江省园林植物与花卉研究所浙江省萧山棉麻研究所，
类型：发明
国别省市：