一种快速分离植物病原真菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速分离植物病原真菌的方法。本发明专利技术方法将患病组织放入70％的乙醇水溶液浸润15s左右，取出，用无菌水浸泡冲洗两次后即可放入培养基中进行纯化培养；克服了传统方法的时间长、步骤多、药剂多且有剧毒的缺点，而最终得到的结果并无差别。本发明专利技术的植物病原真菌分离方法优化了分离过程，祛除有毒有害物质的参与，减少其他化学试剂的使用，能方便、快捷的达到分离植物病原真菌的目的。快捷的达到分离植物病原真菌的目的。快捷的达到分离植物病原真菌的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种快速分离植物病原真菌的方法


[0001]本专利技术属于病原菌分离
，具体涉及一种快速分离植物病原真菌的方法。

技术介绍

[0002]植物病原菌分离技术，是成功分离病原菌的第一步也是重要的步骤之一。病原菌侵入植物组织细胞中，并在植物细胞中定殖造成植物组织如叶片、根、树干的枯萎或死亡，不仅影响植物体的生长发育，严重时还可以引起植株死亡造成绝产绝收的后果，给农林业带来严重的经济损失。因此，明确定殖病原菌类型，针对不同类型的病原菌进行系统的、有目的的防治，有助于减轻或减少病害对植物产生的不良影响以及经济损失。
[0003]植物病原菌的分离，是分离纯化致病菌的第一步也是关键的一步。有关植物病原菌分离采用的普遍方法为首先分别在配置好的70％的乙醇水溶液、0.1％的升汞溶液或者10％的次氯酸钠溶液进行消毒冲洗，其次在无菌水中漂洗两次。具体方法是将包含病健交界处的患病组织放入70％的乙醇水溶液中消毒3
‑
5s，再将患病组织放入已配置好的升汞或次氯酸钠溶液中浸泡3
‑
5min，再放入无菌水中冲洗两次，完成对患病组织的表面消毒，继续放入培养基中进行病原真菌的培养和纯化。上述现有的分离技术需要配置至少两种溶液，步骤繁琐，整个过程耗时较长，花费较多。此外，升汞是一种剧毒物质，长期接触对于人体的中枢神经、消化系统、呼吸系统、肾脏、皮肤等都有严重影响。同时，升汞也禁止没有经过处理直接排入水体，给环境带来巨大的污染，实验室使用过的升汞需要收集起来，进一步进行专业的集中处理，无形中加大了成本的投入。同样，次氯酸钠的危害性虽然相对较轻，但由于其刺激性气味对皮肤黏膜以及呼吸道黏膜具有很强的灼伤作用，尤其是次氯酸钠和酸反应可以生成氯气，氯气经过皮肤黏膜或者呼吸道黏膜、以及眼结膜等可以造成严重的灼伤。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种更为简便的植物病原真菌分离方法。传统的植物病原菌分离中需要配置至少两种化学试剂，且在使用升汞或次氯酸钠进行表面消毒时耗费时间长。同时，升汞具有剧毒，升汞溶液的配置以及废水处理均具有一定的安全隐患，对环境造成一定的负担。因此，传统的植物病原菌分离方法费时费力费钱。本专利技术的快速分离植物病原真菌的方法具有安全、高效、便捷的优点。
[0005]本专利技术方法是一种简便的植物病原真菌分离方法，是通过简化操作步骤，达到优化分离植物病原真菌流程，提高分离效率的目的，为植物病原真菌的分离提供了新方法。
[0006]本专利技术的一种快速分离植物病原真菌的方法，包括以下步骤：
[0007]S1.采集有病斑的叶片，选取叶片的病健交界处，剪下，剪成多个1cm
×
1cm大小的小块叶片备用；
[0008]S2.将步骤S1制备的小块叶片放入体积分数70％的乙醇水溶液中浸泡12s
‑
18s，然后在无菌水中冲洗两次，每次30s以上，用滤纸吸干表面水分；
[0009]S3.将经过步骤S2处理的小块叶片接入培养基中进行分离培养，培养至叶片周围
已长出菌丝后，挑至新的培养基中进行纯化培养直至分离获得纯的病原菌种。
[0010]优选，所述的步骤S1中选取叶片的病健交界处，其中病斑面积约占1/3
‑
1/2。
[0011]优选，所述的步骤S2为：将步骤S1制备的小块叶片放入体积分数70％的乙醇水溶液中浸泡15s，然后在无菌水中冲洗两次，每次30s以上，用滤纸吸干表面水分。
[0012]本专利技术还提供所述的快速分离植物病原真菌的方法在分离植物病原真菌中的应用。
[0013]优选，所述的植物病原真菌为桂花叶斑病病原菌、桂花炭疽病病原菌、桂花叶枯病原菌、链隔孢属真菌和弯孢霉属真菌。
[0014]传统方法中植物病原真菌分离纯化步骤为：
[0015](1)制备病健交界处的组织；
[0016](2)体积分数70％的乙醇水溶液浸泡3
‑
5s；
[0017](3)患病组织放入0.1％的升汞水溶液(剧毒)或10％的次氯酸钠水溶液(强刺激性)
[0018]中3
‑
5min，再进行无菌水冲洗两次，每次30s以上；
[0019](4)然后进行分离培养和纯化培养。
[0020]从上述流程可见，与传统植物病原真菌分离纯化步骤相比，本专利技术直接使用体积分数70％的乙醇水溶液进行表面消毒，15s左右，克服了传统方法中时间长、步骤多、药剂多且有剧毒的缺点，而最终得到的结果并无差别。因此，本专利技术的植物病原真菌的分离方法可以达到优化分离过程，祛除有毒有害物质的参与，减少其他化学试剂的使用，方便、快捷的达到分离植物病原真菌的目的。
附图说明
[0021]图1是植物病原真菌分离方法中病叶消毒操作流程示意图。
[0022]图2是分离得到的病原真菌Botryosphaeria dothidea(葡萄座腔菌)点接种到健康的桂花叶片验证；其中，实验组：利用成功分离并纯化培养的真菌(PDA培养基)点接种到健康的桂花叶片(适宜温度湿度条件下培养7天)；对照组：利用空白培养基(PDA)点接种到健康的桂花叶片(适宜温度湿度条件下培养7天)。
[0023]图3分离得到的病原菌Colletotrichum点接种到健康的桂花叶片验证；其中，实验组：利用成功分离并纯化培养的真菌(PDA培养基)点接种到健康的桂花叶片(适宜温度湿度条件下培养7天)；对照组：利用空白培养基(PDA)点接种到健康的桂花叶片(适宜温度湿度条件下培养7天)。
具体实施方式
[0024]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0025]实施例1
[0026]本实施例的植物病原真菌分离方法，包括以下步骤：
[0027]1.采集病叶
[0028]在田间选取有病斑的桂花叶片，最好是大部分叶片是健康的，在叶尖、叶缘或者叶片表面存在病斑以及病健交界处。
[0029]2.制备叶片
[0030]将所需要的桂花叶片的病健交界处剪下，病斑面积约占1/3
‑
1/2。然后再将其剪成1cm
×
1cm大小的小块叶片备用，数个。
[0031]3.病叶消毒
[0032]操作流程如图1所示。提前配置好体积分数70％的乙醇水溶液，并准备两份无菌水。将一份体积分数70％的乙醇水溶液、两份无菌水分别倒入3个培养皿中，将步骤2中制备好的小块叶片，5
‑
10片，先放入体积分数70％的乙醇水溶液中(保证叶片全部浸润在溶液中)15s(时间可根据叶片厚度适当调整，一般为12s
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18s))，用镊子取出。继续放入装有无菌水的培养皿中，洗脱，两次，每次30s以上(本实施例中为30s)，祛除表面的乙醇成分。最后夹出叶片，放在滤纸上，将小块叶片表面水分吸干。
[0033]4.分离培养
[0034]将经过步骤3处理好的小块叶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速分离植物病原真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采集有病斑的叶片，选取叶片的病健交界处，剪下，剪成多个1cm
×
1cm大小的小块叶片备用；S2.将步骤S1制备的小块叶片放入体积分数70％的乙醇水溶液中浸泡12s
‑
18s，然后在无菌水中冲洗两次，每次30s以上，用滤纸吸干表面水分；S3.将经过步骤S2处理的小块叶片接入培养基中进行分离培养，培养至叶片周围已长出菌丝后，挑至新的培养基中进行纯化培养直至分离获得纯的病原菌种。2.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王士臻，张娟，李明江，苏红利，
申请(专利权)人：浙江省园林植物与花卉研究所浙江省萧山棉麻研究所，
类型：发明
国别省市：