一种肠道微生物常温保存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种肠道微生物常温保存液，属于分子生物学肠道菌群领域，是由如下组分组成：缓冲液0.05

【技术实现步骤摘要】
一种肠道微生物常温保存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学肠道菌群领域，具体涉及一种肠道微生物样品常温保存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人体微生物相关研究突发猛进，原来都被人们看作不利人体健康的细菌们居然大量分布于人体体表和体内。肠道菌群可被视为人体的“微生物器官”，通过菌群的自身成分、代谢物和衍生物，以及致病共生菌移位等机制，参与调控宿主的代谢、免疫、内分泌、神经等多方面的局部和全身性生理过程，从而影响发生感染性疾病、肠道慢性炎症疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病、精神神经疾病和癌症等疾病的风险。儿童特别是婴幼儿，经历了肠道菌群从无到有、从简单到复杂、从不稳定到稳定的过程，即生态学的演替。胎儿在母体子宫内处于基本无菌的环境，出生后新生儿立即暴露于产道和周围环境中，外界的微生物开始在新生儿的肠道内定植，2
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3岁左右发展至接近成人状态。生命早期一千天是肠道菌群建立的关键窗口期，但这一时期肠道菌群比较脆弱、多样性低，易受多种因素的影响，如胎龄、出生方式(顺产或剖宫产)、喂养方式(母乳喂养、奶粉喂养)、饮食、使用抗生素以及卫生情况，因此需要密切关注。
[0003]肠道菌群检测对临床诊断和治疗具有非常重要的辅助意义。肠道菌群可被视为身体中的“微生物器官”，参与调控宿主的代谢、免疫、内分泌、神经等多方面的局部和全身性生理过程，从而影响各种疾病的发生发展。
[0004]人体肠道菌群的密度可达10
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CFU/mL，种类范围在100～1000种，且绝大部分(99％以上)都是严格厌氧菌，难以通过传统微生物学检测技术进行分离培养，故无法检出。近年来，随着高通量基因测序技术(又称二代基因测序技术，Next generation sequencing，NGS)的发展，基于非培养的分子生物学技术手段，不依赖对样品中微生物群落的培养，直接对样品进行核酸提取，测定样品中所有微生物的核酸序列，其深入并且快速的测序过程使之成为现今应用最广泛的测序技术，在微生物研究中发挥着日益重要的作用。
[0005]目前，人肠道微生物的检测方法基本为16S二代测序技术：16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，一般由保守区和高变区组成，保守区在细菌间无显著差异，可用于构建所有生命的统一进化树，而高变区在不同细菌中存在一定的差异，可将菌群鉴定精确到分类学上属、甚至种水平。16SrRNA基因测序，通常是选择某个或某几个高变区域，利用保守区设计通用引物进行PCR扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，从而获得肠道微生物群落的多样性。
[0006]粪便是提取肠道微生物核酸的来源。样品离体后，因取样地点与实验条件的限制，如果无法进行及时的核酸提取，会导致菌群的数量、种类及丰度发生变化。如何在收集样品后保证肠道菌群的稳定，是提高肠道微生物宏基因组测序分析准确性的关键。传统采用冷藏法保存，即样品采集后存放于
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20℃或更低的温度中，使其中的肠道微生物处于低代谢速率下，在一段时间内稳定菌群的数量与组成，然而冷藏法依然受限于采样条件，对于样品运
输来说需要更高的成本，并且保存质量会因为是否冷藏及时产生较大的影响。因此，开发一种能够有效保持肠道菌群的稳定性，且无毒或腐蚀成分，不妨碍下游检测，操作安全方便的保存液，具有很高的市场价值。
[0007]目前最常用的保存方法为样品采集后立即冻存于
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80℃的冰箱中。由于细菌在低温状态下代谢速率极大的降低，因此可以在一段时间内维持粪便中细菌的构成。由于该冻存条件很多情况下难以达到，构成了此种保存方法最大的缺陷。
[0008]很多时候需要受检者自行采样，如样品采集后不能及时冻存，也会导致样品中菌群结构及丰度可能已经发生很大变化，样品再用于检测实验已经无法保证准确性。

技术实现思路

[0009]为克服上述现有技术的瓶颈，本专利技术提出一种肠道微生物样品常温保存液及其制备方法和应用，使用此保存液，将采集的样品直接置于保存液中，无需冻存，常温条件下能维持样品中微生物结构组成的稳定，即可达到稳定其中微生物构成的作用；方便受检者在任何时候任何地点完成样品采集和保存，同时也方便样品的常温保存和运输。
[0010]本专利技术的技术方案为：一种肠道微生物常温保存液，是由如下组分组成：缓冲液0.05
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0.3M、抗凝剂0.2
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0.4M、蛋白变性剂0.2
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0.6M、离子强度维持剂0.3
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8mM、余量为去离子水。
[0011]其中，所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷或三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。
[0012]其中，所述抗凝剂为EDTA或EDTA可溶性盐。
[0013]其中，所述蛋白变性剂为盐酸胍、异硫氰酸胍或十二烷基磺酸钠。
[0014]其中，离子强度维持剂为氯化钠。
[0015]其中，所述去离子水为沸腾的无菌无核酸酶去离子水。
[0016]一种肠道微生物常温保存液的制备方法，包括下述步骤：取缓冲液、抗凝剂、蛋白变性剂和离子强度维持剂混合后，用去离子水溶解，磁力搅拌器搅拌混匀；使用0.2μm的滤膜过滤后，即得。
[0017]肠道微生物常温保存液在常温保存肠道微生物方面的应用。
[0018]本专利技术提供的技术方案，与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0019]本专利技术的粪便保存液利用抗凝剂为EDTA及其可溶性盐，缓冲液为Tris、Tris
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HCl，离子强度维持剂为氯化钠，蛋白变性剂为盐酸胍，或异硫氰酸胍，或十二烷基磺酸钠(SDS)。经过合理组方，可以使样品中微生物的数量、组成和丰度稳定，从而保证人肠道菌群测序分析的准确性，实现粪便样本的常温保存，相对于现有的保存液，不仅保存效果好，操作更安全。
附图说明
[0020]图1为实例中相对丰度柱形图；
[0021]图2为保存液1在不同时间监控点时同一菌属相对丰度随时间的变化图；
[0022]图3为保存液2在不同时间监控点时同一菌属相对丰度随时间的变化图；
[0023]图4为保存液3在不同时间监控点时同一菌属相对丰度随时间的变化图；
[0024]图5为德诺杰亿保存液在不同时间监控点时同一菌属相对丰度随时间的变化图；
[0025]图6为保存液1、保存液2、保存液3和德诺杰亿保存液菌属数据分析结果表。
具体实施方式
[0026]下面将结合本专利技术具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1
[0028]本实施例提供一种肠道微生物常温保存液，是由如下组分组成：三(羟甲基)氨基甲烷0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠道微生物常温保存液，其特征在于是由如下组分组成：缓冲液0.05
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0.3M、抗凝剂0.2
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0.4M、蛋白变性剂0.2
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0.6M、离子强度维持剂0.3
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8mM、余量为去离子水。2.根据权利要求1所述的一种肠道微生物常温保存液，其特征在于：所述缓冲液为三(羟甲基)氨基甲烷或三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐。3.根据权利要求1所述的一种肠道微生物常温保存液，其特征在于：所述抗凝剂为EDTA或EDTA可溶性盐。4.根据权利要求1所述的一种肠道微生物常温保存液，其特征在于：所述蛋白变性...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑明权，李巧玲，
申请(专利权)人：艾德范思北京医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：