一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法及其应用技术

本发明专利技术一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法，本发明专利技术将LaCl3应用于海水中细菌和病毒及核酸的富集，而且本发明专利技术方法所需处理的水体的体积少，所需抽滤装置、滤膜和离心管等装置和耗材成本低，程序简洁，能够在约2h时间获得海水微生物及核酸的絮凝浓缩液，本发明专利技术还提供了浓缩液的核酸提取方法，大大提高了针对海洋细菌和病毒检测的效率，适于进行特定细菌和病毒物种的快速检测技术的研发。本发明专利技术提供了海水及其微生物絮凝物的暂存和储运条件，为海水样品的原位采集、预处理和有效储运提供了支撑。预处理和有效储运提供了支撑。预处理和有效储运提供了支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法及其应用


[0001]本专利技术属于水产养殖检测
，具体涉及一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法及其应用。

技术介绍

[0002]细菌和病毒是海洋中重要的生命形式，其中致病性细菌和病毒是引起海水养殖动物病害的主要病原。目前海水养殖动物病原检测主要是检测养殖动物组织及检测组织中的核酸，尚缺乏基于养殖水的病原检测技术，而海水环境微生物及核酸的富集是亟需解决的关键技术之一。
[0003]凡纳滨对虾是我国重要的海水养殖对虾品种之一，而病害问题已经成为凡纳滨对虾乃至对虾养殖产业可持续发展的瓶颈，其中急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)和白斑综合征(White spot syndrome)是严重影响对虾健康养殖的重要疫病，其病原分别是致急性肝胰腺坏死病弧菌(AHPND
‑
causing Vibrio，V
AHPND
)和白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)。V
AHPND
和WSSV是对虾养殖过程病害监测的重要目标，这就需要对养殖原水、养殖水和养殖尾水中的细菌、病毒和核酸进行检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对对虾等海水养殖动物养殖过程中的病原检测和防控的需求，提供一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法及其应用，进而满足海洋细菌和病毒物种和遗传多样性研究的需要。
[0005]本专利技术所提供的一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法，包括如下的步骤：
[0006]1)用无菌水样采集袋采集海水，优选在冷冻条件下进行避光暂存和运输；
[0007]进一步的，采集的海水样品优选在4℃或
‑
20℃及更低温度下暂存，
[0008]作为优选，在4℃条件下暂存不超过一天后进行处理，或是在
‑
20℃暂存不超过14天；
[0009]2)将采集的海水进行过滤，收集滤液；
[0010]更进一步的，将采集的海水依次经过3μm和0.22μm滤膜过滤来富集病毒；
[0011]优选的，是将采集的海水只经过3μm滤膜过滤来富集细菌和病毒。
[0012]3)向滤液中加入LaCl3溶液至终浓度为0.2mM，剧烈振荡后，在低温条件下进行避光絮凝和沉淀，产生絮凝物；
[0013]所述的在低温条件下进行避光絮凝和沉淀，优选在冰水浴中进行避光絮凝和沉淀至少1h，或是在4℃避光静置进行絮凝和沉淀过夜；
[0014]4)收集絮凝物，所述的收集絮凝物，其一种方法是使用真空抽滤装置将步骤3)沉淀后的絮凝物收集在孔径为0.22μm的混合纤维素滤膜上；可选将滤膜在冷藏或冷冻条件下储存备用(可至14d)；使用无菌EDTA溶液(0.1M；pH 8.0)将新制备或储存后的滤膜上的絮凝
物进行溶解和洗脱，收集所得浓缩液；
[0015]另一种方法，是将步骤3)的沉淀后的絮凝物进行离心收集沉淀，使用无菌EDTA溶液(0.1M；pH 8.0)将沉淀溶解，收集所得浓缩液；将所得浓缩液转移至DNase/RNase
‑
free离心管中，于
‑
80℃储存；
[0016]5)将步骤4)获得的浓缩液提取总DNA或RNA。
[0017]总DNA提取使用病毒基因组DNA提取试剂盒，按照产品说明书步骤进行；总RNA提取使用Trizol类试剂，按照产品说明书步骤进行，必要时使用DNase I去除提取的总RNA中残存的DNA。
[0018]本专利技术提供了一套涉及海水样品采集和暂存、微生物絮凝、富集和暂存、微生物絮凝浓缩液的核酸提取的方案。本专利技术将LaCl3应用于海水中细菌和病毒及核酸的富集，而且本专利技术方法所需处理的水体的体积少，所需抽滤装置、滤膜和离心管等装置和耗材成本低，程序简洁，能够在约2h时间获得海水微生物絮凝浓缩液。本专利技术提供了海水及其微生物絮凝物的暂存条件，为海水及其微生物的原位采集、预处理和有效储运提供了支撑。本专利技术还提供了微生物絮凝浓缩液的核酸提取方法，大大提高了针对海洋细菌和病毒检测的效率，适于进行特定细菌和病毒物种的快速检测技术的研发，以及微生物物种和遗传多样性的研究。
附图说明
[0019]图1：养殖海水样品在4℃和
‑
20℃暂存不同时间，经过离心或过滤收集絮凝物后提取的总DNA和总RNA的效果图，其中A和B来源于
‑
20℃暂存的海水样品，C和D来源于4℃暂存的海水样品。RNA经DNase I处理。
[0020]图2：养殖海水样品在4℃和
‑
20℃暂存不同时间，经离心或过滤收集的絮凝物用于噬菌体g23基因的PCR检测效果图(DNA水平)。
[0021]图3：养殖海水样品在4℃和
‑
20℃暂存，经离心或过滤收集的絮凝物用于细菌16S rRNA基因的PCR检测效果图样(RNA水平)。
[0022]图4：养殖海水样品在4℃暂存不同时间，经过离心或过滤收集絮凝物后用于细菌16S rRNA基因丰度的qPCR检测效果(DNA水平)。
[0023]图5：絮凝浓缩物滤膜在4℃和
‑
20℃暂存不同时间后用于噬菌体g23基因的PCR检测效果图(DNA水平)。
[0024]图6：絮凝浓缩物滤膜在4℃和
‑
20℃暂存不同时间后用于细菌16SrRNA基因的PCR检测效果图(RNA水平)。
[0025]图7：养殖海水中WSSV的PCR(A)和qPCR(B)检测效果图。
[0026]图8：养殖海水中V
AHPND pirA
vp
基因的PCR检测效果图。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一套涉及海水样品采集和暂存、微生物絮凝、富集和暂存、微生物絮凝浓缩液的核酸提取的方案，提供了一种经济、高效地富集海水细菌和病毒及核酸的方法，实现了针对养殖海水环境细菌和病毒(包括对虾病原V
AHPND
和WSSV)的有效(q)PCR检测，为基于养殖原水、养殖水或养殖尾水的海水养殖动物养殖过程病原检测和防控，以及海洋环境
细菌和病毒物种和遗传多样性研究提供技术支撑。
[0028]下面结合实施案例及附图和附表对本专利技术做进一步说明。相关技术人员应当清楚，所描述的实施示例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例。
[0029]实施例1养殖海水细菌和病毒及核酸的富集和检测
[0030]1)用无菌水样采集袋采集凡纳滨对虾养殖水，每份约600ml，其中3份在4℃储存，另外3份在
‑
20℃储存。
[0031]2)海水在4℃分别储存0d、1d和7d，在
‑
20℃分别储存7d和14d后，在室温条件下，使用真空抽滤装置将150ml海水过滤孔径3μm的混合纤维素滤膜(直径5cm)，收集所得滤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种富集海水细菌、病毒和核酸的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)用无菌水样采集袋采集海水，在冷冻条件下进行避光暂存和运输；2)将采集的海水进行过滤，收集滤液；3)向滤液中加入LaCl3溶液至终浓度为0.2mM，剧烈振荡后，在低温条件下进行避光絮凝和沉淀，产生絮凝物；4)收集絮凝物，获得包含有总DNA或RNA的浓缩液；5)将步骤4)获得的浓缩液提取总DNA或RNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采集的海水样品在4℃、
‑
20℃或更低温度下暂存。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的，在4℃条件下暂存不超过一天后进行处理，或是在
‑
20℃暂存不超过14天。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2)中是将采集的海水依次经过3μm和0.22μm滤膜过滤来富集病毒，或是将采集的海水只经过3μm滤膜过滤来富集细菌和病毒。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海亮，
申请(专利权)人：青岛海洋科学与技术国家实验室发展中心，
类型：发明
国别省市：