用于生产赤藓糖醇的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于生产赤藓糖醇的工程菌及其应用

【技术实现步骤摘要】
用于生产赤藓糖醇的工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物催化领域，尤其涉及用于生产赤藓糖醇的工程菌及其应用
。

技术介绍

[0002]赤藓糖醇，又名
1,2,3,4
‑
丁四醇，是一种天然存在的增甜剂，其相对甜度为蔗糖的
70
％
。
由于其具有不会影响血糖和胰岛素的水平，并不能被口腔微生物代谢等特点，因此非常适合糖尿病人和肥胖人群使用，同时可避免龋齿形成
。
与其他多元醇类的糖替代品不同，赤藓糖醇的分子量很小，仅为
122.12
，且对人体的耐受性更好
。
随着人们健康意识的提高，赤藓糖醇作为重要的蔗糖替代品市场需求量正在不断扩大
。
[0003]化学法生产赤藓糖醇由于选择性差
、
得率低
、
成本高等特点很难实现工业化生产
。
目前工业上主要采用发酵法生产赤藓糖醇，通常以淀粉原料，将淀粉水解为葡萄糖，再经微生物发酵将其转化为赤藓糖醇
。
再经过滤
、
离子交换
、
浓缩结晶
、
干燥精致最终得到高纯度的赤藓糖醇
。
[0004]目前微生物发酵转化主要采用的原料是葡萄糖，也有研究报道尝试用甘油和木糖等原料
。
已报道的赤藓糖醇生产菌株主要为圆酵母属
(Torula sp.)、
小丛梗孢属
(Moniliella sp.)、
木兰假丝酵母
(Candida magnoliae)、
解脂耶氏酵母
(Yarrowia lipolytica)
和出芽短梗霉
(Aureobasidium pulluans)
等
。
最终发酵产量可达
31.75
‑
241g/L
，产率在
26
％和
77
％之间
。
[0005]以甲醇为代表的一碳化合物由于储量丰富
、
价格低廉，而且将来有望实现可再生生产，被认为最有希望替代传统葡萄糖为代表的糖基原料之一
。
我国煤炭资源丰富，甲醇价格持续保持低位，甲醇原料用于生物转化在成本上具有吸引力
。
另外甲醇具有原料纯度高
、
发酵培养基简单易于分离纯化，发酵过程不易染菌等特点
。
因此，用甲醇为原料生产赤藓糖醇将具有重要的应用价值
。

技术实现思路

[0006]本专利技术一个目的是提供一种制备重组酵母菌的方法
。
[0007]本专利技术提供的方法，包括如下步骤：在毕赤酵母菌中表达4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因，得到重组菌
。
[0008]上述方法中，所述在毕赤酵母菌中表达4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因为将所述4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和所述赤藓糖还原酶编码基因整合到所述毕赤酵母菌基因组中
。
[0009]上述方法中，所述4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因为1或2个拷贝；
[0010]所述赤藓糖还原酶编码基因为1或2个拷贝；
[0011]所述整合为通过线性化的表达4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因的载体导入所述毕赤酵母菌中，实现整合
。
[0012]上述方法中，所述载体包括1个或2个含有4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓
糖还原酶编码基因的表达盒以及整合位点序列；
[0013]每个所述含有4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因的表达盒包括驱动4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因表达的启动子
、4
‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因
、4
‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因表达的终止子
、
驱动赤藓糖还原酶编码基因表达的启动子
、
赤藓糖还原酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因表达的终止子
。
上述整合位点序列为
His4
基因
。
[0014]在本专利技术的实施例中，所述毕赤酵母菌为毕赤酵母野生型
GS115。
[0015]上述方法中，所述4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶来源于大肠杆菌，具体为如下
1)
或
2)
：
[0016]1)
由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；
[0017]2)
将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
[0018]/
或缺失和
/
或添加且具有相同功能的由
(1)
衍生的蛋白质
。
[0019]所述赤藓糖还原酶来源于木兰假丝酵母，为如下
3)
或
4)
：
[0020]3)
由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；
[0021]4)
将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
[0022]/
或缺失和
/
或添加且具有相同功能的由
3)
衍生的蛋白质
。
[0023]在本专利技术的实施例中，上述每个所述含有4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因的表达盒为序列6；
[0024]所述载体为
pMPICZa
‑
AY
‑
His4
或
pMPICZa
‑
2AY
‑
His4
；
[0025]所述
pMPICZa
‑
AY
‑
His4
为将序列7所示的
His4
扩增片段替换
pMPICZa
‑
AY
载体的
SphI
和
BglII
酶切位点间的序列，得到的载体，该载体含有1个
ALR
‑
YidA
表达盒
。
[0026]表达载体
pMPICZa
‑
2AY
‑
His4
为将序列序列7所示的
His4
扩增片段替换
pMPICZa
‑
2AY
载体的
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种制备重组酵母菌的方法，包括如下步骤：在毕赤酵母菌中表达4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因，得到重组菌
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在毕赤酵母菌中表达4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和赤藓糖还原酶编码基因为将所述4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因和所述赤藓糖还原酶编码基因整合到所述毕赤酵母菌基因组中
。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述4‑
磷酸
‑
赤藓糖磷酸酶编码基因为1或2个拷贝；所述赤藓糖还原酶编码基因为1或2个拷贝
。4.
根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱泰承，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：