一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法

【技术实现步骤摘要】
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及临床医学参数检测
，具体涉及一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法
。

技术介绍

[0002]天门冬氨酸氨基转移酶
(AST)
广泛存在于心
、
肝
、
肺等组织细胞内，其有两种同工酶，一种是存在于细胞胞浆中，称为胞浆天门冬氨酸氨基转移酶
(c
‑
AST)
，另一种是存在于线粒体中的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶
(m
‑
AST)。AST
浓度变化具有重要的临床诊断意义，其中
m
‑
AST
能够比较客观地反映一些疾病的严重程度，能够作为一些疾病指导治疗及预后判断指标的重要参考
。
[0003]目前，对于
m
‑
AST
的检测方法主要有电泳法
、
离子交换法
、
酶免疫法
、
放射性免疫法等
。
电泳法需要复杂的染色过程，不适用于大量样本的临床检测；离子交换法需要使用层析柱，不能达到快速检测的目的；酶免疫法自动化程度低，耗费较多人力；放射性免疫法具有放射性，对环境不友好
。
[0004]m
‑
AST
的酶动力学法是根据
m
‑
AST
催化的化学反应的速度反推
>m
‑
AST
的酶活或者浓度，具有操作可自动化
、
样本通量大，检测时间短等优势
。
检测基本原理是：
mAST
催化
L
‑
天冬氨酸和
α
‑
酮戊二酸生成草酰乙酸和
L
‑
谷氨酸，草酰乙酸被苹果酸脱氢酶
(MDH)
还原成
L
‑
苹果酸，同时还原型辅酶Ⅰ(NADH)
被氧化为氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)
，从而使
340nm
处的吸光度下降
。
通过监测
340nm
处吸光度下降的速率，可以计算出样品中
mAST
的活性
。
但是容易受到
c
‑
AST
的干扰，导致检测结果偏差较大的问题
。
因此需要开发一种能够消除
c
‑
AST
干扰，准确测定
m
‑
AST
浓度的检测试剂盒及其制备方法
。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒及其制备方法，通过在试剂盒中增设胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜将待测样本中的
c
‑
AST
去除，消除测定干扰，并同时去除待测样本中原始存在的
L
‑
天冬氨酸和
α
‑
酮戊二酸，降低背景值，提高检测精度
。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，所述检测试剂盒包括胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜
、
第一试剂
、
第二试剂和第三试剂；
[0008]所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜的结构为：两层醋酸纤维素膜中间区域夹有丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒；
[0009]所述两层醋酸纤维素膜中间区域是指除距膜边缘2‑
5mm
区域以外的膜中间区域；
[0010]所述醋酸纤维素膜为负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸
纤维素膜；
[0011]所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体由第一特异性单克隆抗体和第二单克隆抗体按照摩尔比
1:2
‑
2:1
组成，所述第一特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为
LAN HLE IYG LLE FAS NAM RLA
，所述第二特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为
KEI ASN MKH RQL FPF FGS
；
[0012]所述第一试剂包括第一缓冲液
30
‑
110mmol/L、
氢氧化钾
0.5
‑
0.6mmol/L、
丙三醇
0.3
‑
1.2g/L、
聚乙二醇
0.1
‑
0.9g/L、
乙醇胺
0.1
‑
2mmol/L、
还原型辅酶ⅠNADH200
‑
270 mmol/L、
第一抑菌剂
30mg/L
‑
69mg/L、
抗氧化剂
140
‑
310mg/L
；
[0013]所述第二试剂包括第二缓冲液
60
‑
90mmol/L、
苹果酸脱氢酶3‑
6kU/L、
表面活性剂
20
‑
67mmol/L、
第二抑菌剂
50mg/L
‑
90mg/L、
蛋白稳定剂
40
‑
70mmol/L
；
[0014]所述第三试剂包括第三缓冲液
50
‑
100mmol/L、L
‑
天冬氨酸
30
‑
50mmol/L、
α
‑
酮戊二酸
30
‑
50mmol/L、
第三抑菌剂
40mg/L
‑
80mg/L。
[0015]优选地，所述醋酸纤维素膜的孔径为
0.45
微米
。
[0016]优选地，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂包括弱碱性阴离子交换树脂
。
[0017]优选地，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的层数为1‑3层，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的粒径为
0.9
‑
1.3
微米
。
[0018]优选地，所述第一抑菌剂和第三抑菌剂包括庆大霉素，第二抑菌剂包括叠氮钠，第一缓冲液和第三缓冲液包括磷酸盐缓冲液，第二缓冲液为
Tris
缓冲液，表面活性剂包括月桂酰二乙醇胺
、
吐温
60、
吐温
80
中的至少一种，抗氧化剂包括维生素
C
，蛋白稳定剂包括烷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜
、
第一试剂
、
第二试剂和第三试剂；所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性吸附膜的结构为：两层醋酸纤维素膜中间区域夹有丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒；所述两层醋酸纤维素膜中间区域是指除距膜边缘2‑
5mm
区域以外的膜中间区域；所述醋酸纤维素膜为负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜；所述胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体由第一特异性单克隆抗体和第二单克隆抗体按照摩尔比
1:2
‑
2:1
组成，所述第一特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为
LAN HLE IYG LLE FAS NAM RLA
，所述第二特异性单克隆抗体对应的抗原决定簇氨基酸序列为
KEI ASN MKH RQL FPF FGS
；所述第一试剂包括第一缓冲液
30
‑
110mmol/L、
氢氧化钾
0.5
‑
0.6mmol/L、
丙三醇
0.3
‑
1.2g/L、
聚乙二醇
0.1
‑
0.9g/L、
乙醇胺
0.1
‑
2mmol/L、
还原型辅酶ⅠNADH200
‑
270 mmol/L、
第一抑菌剂
30mg/L
‑
69mg/L、
抗氧化剂
140
‑
310mg/L
；所述第二试剂包括第二缓冲液
60
‑
90mmol/L、
苹果酸脱氢酶3‑
6kU/L、
表面活性剂
20
‑
67mmol/L、
第二抑菌剂
50mg/L
‑
90mg/L、
蛋白稳定剂
40
‑
70mmol/L
；所述第三试剂包括第三缓冲液
50
‑
100mmol/L、L
‑
天冬氨酸
30
‑
50mmol/L、
α
‑
酮戊二酸
30
‑
50mmol/L、
第三抑菌剂
40mg/L
‑
80mg/L。2.
根据权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述醋酸纤维素膜的孔径为
0.45
微米
。3.
根据权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂包括弱碱性阴离子交换树脂
。4.
根据权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的层数为1‑3层，所述丙烯酸系凝胶型阴离子交换树脂颗粒的粒径为
0.9
‑
1.3
微米
。5.
根据权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一抑菌剂和第三抑菌剂包括庆大霉素，第二抑菌剂包括叠氮钠，第一缓冲液和第三缓冲液包括磷酸盐缓冲液，第二缓冲液为
Tris
缓冲液，表面活性剂包括月桂酰二乙醇胺
、
吐温
60、
吐温
80
中的至少一种，抗氧化剂包括维生素
C
，蛋白稳定剂包括烷基糖苷
、
低聚海藻糖中的至少一种
。6.
根据权利要求1所述的天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒还包括膜洗涤试剂，所述膜洗涤试剂包括第一缓冲液
30
‑
110mmol/L、
氢氧化钾
0.06
‑
0.09mmol/L、
丙三醇
0.3
‑
1.2g/L、
聚乙二醇
0.1
‑
0.9g/L、
第一抑菌剂
30mg/L
‑
69mg/L、
抗氧化剂
140
‑
310mg/L。7.
一种如权利要求1‑6任一项所述天门冬氨酸氨基转移酶线粒体同工酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：制备胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体：按照常规方法制备所述第一特异性单克隆抗体和第二特异性单克隆抗体，所述第一特异性单克隆抗体和第二特异性单克隆抗体为羊抗人单克隆抗体；所述用于制备第一特异性单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列
为
LAN HLE IYG LLE FAS NAM RLA
，所述用于制备第二特异性单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列为
KEI ASN MKH RQL FPF FGS
；制备负载胞浆天门冬氨酸氨基转移酶特异性单克隆抗体的醋酸纤维素膜：将所述醋酸纤维素膜浸没于磷酸缓冲液中，加入活化剂
NHS
‑
EDC
，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伊琳，王贤理，池万余，卢强，邓慰，苗准，王友群，周招英，
申请(专利权)人：浙江伊利康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：