一种脂联素检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脂联素检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂，第一试剂包括解离剂，第二试剂包括解离剂淬灭剂和包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒，第三试剂包括包被脂联素单克隆抗体的胶乳颗粒。该检测试剂盒的制备方法包括脂联素蛋白片段和包被该片段的胶乳颗粒的制备步骤。本发明专利技术通过通过在第一试剂中增加解离剂，与第一试剂的其他组分协同作用，使六聚体及以上的脂联素解离为三聚体；在第二试剂中增加解离剂的淬灭剂和包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒，使脂联素三聚体与胶乳颗粒上的脂联素蛋白片段结合，而不会重新聚合为六聚体及以上的形态，可保持脂联素存在形态的单一性，从而提高检测准确性和抗干扰能力。准确性和抗干扰能力。

【技术实现步骤摘要】
一种脂联素检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及临床医学参数检测
，具体涉及一种脂联素检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，可分为三聚体(LMW)、六聚体(HMW)和多聚体(MMT)三种形态，是一种胰岛素增敏激素，研究发现其能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症，在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力，且脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，可以作为相关健康状况的判断指标，因此其检测结果的灵敏度、准确性在临床领域至关重要。
[0003]目前脂联素的检测方法主要包括：放射免疫分析法，酶联免疫法，化学发光法、胶乳增强免疫比浊法等。放射免疫分析法涉及使用放射性物质，对环境造成污染，还会对医务人员身体健康产生损害；酶联免疫法灵敏度高，但操作步骤多，耗时长，检测不及时；化学发光法由于需要化学发光物质或者基团的引入，操作繁琐，试剂成本高、仪器普及率低的问题。
[0004]胶乳免疫增强比浊法是一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。但胶乳免疫增强比浊法存在抗干扰能力差，无法区分脂联素三聚体、六聚体和多聚体的多种形式，造成检测结果有所偏差。因此需要开发一种抗干扰能力强，且能够消除脂联素多种形式造成的检测结果偏差的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种脂联素的检测试剂盒及其制备方法，一方面，通过在第一试剂中增加具有两个及以上羧基的有机酸作为解离剂，与第一试剂的其他组分协同作用，使六聚体及以上的脂联素解离为三聚体；另一方面，在第二试剂中增加解离剂的淬灭剂和包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒，使脂联素三聚体与胶乳颗粒上的脂联素蛋白片段结合，而不会重新聚合为六聚体及以上的形态，有利于保持脂联素存在形态的单一性，从而提高检测准确性和抗干扰能力。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种脂联素检测试剂盒，所述脂联素检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；
[0008]所述第一试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、蛋白稳定剂、解离剂；
[0009]所述第二试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、促凝剂、解离剂淬灭剂、包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒；
[0010]所述第三试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、包被脂联素单克隆抗体的胶乳颗粒；
[0011]所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、甘氨酸缓冲液或其组合，浓度为36
‑
480mmol/L，pH值为5.3
‑
8.6；所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或其组合，浓度为0.1％
‑
1.3％；所述防腐剂为Proclin300、叠氮钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯，浓度为0.08％
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0.45％；所述表面活性剂为聚山梨酯、烷基葡糖苷、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚或其组合，浓度为0.17％
‑
3.6％；所述蛋白稳定剂为丙三醇、甘露醇、酪蛋白、牛血清白蛋白或其组合，浓度为0.3％
‑
2.1％；所述促凝剂为聚乙二醇，质量浓度为0.6％
‑
6％；
[0012]所述解离剂包括含有两个以上羧基的有机酸，浓度为20
‑
230mmol/L，其作用是促进待测样品中脂联素六聚体及以上多聚体解离为脂联素三聚体；
[0013]所述解离剂淬灭剂包括可溶性钙盐，和/或，可溶性镁盐，浓度为60
‑
440mmol/L，其作用是与所述解离剂结合，使所述解离剂失去解离脂联素六聚体及以上多聚体的能力；
[0014]所述胶乳颗粒是由苯乙烯和丙烯酸聚合而成的共聚物，表面存在羧基基团，平均粒径范围为60
‑
140nm，所述苯乙烯与丙烯酸的质量比为(1
‑
3)：1；
[0015]所述脂联素蛋白片段的氨基酸序列为如下，从氨基端开始：GVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGAYGVPGEKGDPGLIGPKGDIGETGIPGHPGPKGA PGRDGVPGTP；
[0016]所述脂联素单克隆抗体是通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒表面，所用化学交联剂选自EDC、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾或其组合；
[0017]所述包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒在所述第二试剂中的浓度为0.1
‑
1.1mg/mL；
[0018]所述包被脂联素单克隆抗体的胶乳颗粒在所述第三试剂中的浓度为1.4
‑
5.6mg/mL。
[0019]优选地，所述聚乙二醇的分子量为1000
‑
7000。
[0020]优选地，所述含有两个以上羧基的有机酸包括乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、柠檬酸、酒石酸、丁二酸中的一种或者几种。
[0021]优选地，所述可溶性钙盐包括氯化钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或者几种，可溶性镁盐包括氯化镁、硝酸镁、醋酸镁中的一种或者几种。
[0022]优选地，所述脂联素蛋白片段是通过化学交联的方法偶联于所述胶乳颗粒表面，所用化学交联剂选自EDC、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼或其组合。
[0023]第二方面，本专利技术提供一种如上所述脂联素检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
[0024]根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：缓冲液36
‑
480mmol/L、电解质0.1％
‑
1.3％、防腐剂0.08％
‑
0.45％、表面活性剂0.17％
‑
3.6％、蛋白稳定剂0.3％
‑
2.1％、解离剂20
‑
230mmol/L，溶解于相应体积的去离子水中，得到第一试剂；
[0025]根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：缓冲液36
‑
480mmol/L、电解质0.1％
‑
1.3％、防腐剂0.08％
‑
0.45％、表面活性剂0.17％
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3.6％、促凝剂0.6％
‑
6％、解离剂淬灭剂60
‑
440mmol/L、包被脂联素蛋白片段的胶乳颗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素检测试剂盒包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；所述第一试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、蛋白稳定剂、解离剂；所述第二试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、促凝剂、解离剂淬灭剂、包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒；所述第三试剂包括缓冲液、电解质、防腐剂、表面活性剂、包被脂联素单克隆抗体的胶乳颗粒；所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、甘氨酸缓冲液或其组合，浓度为36
‑
480mmol/L，pH值为5.3
‑
8.6；所述电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或其组合，浓度为0.1％
‑
1.3％；所述防腐剂为Proclin300、叠氮钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯，浓度为0.08％
‑
0.45％；所述表面活性剂为聚山梨酯、烷基葡糖苷、失水山梨醇脂肪酸酯、脂肪醇聚乙二醇醚、聚氧乙烯苯基醚或其组合，浓度为0.17％
‑
3.6％；所述蛋白稳定剂为丙三醇、甘露醇、酪蛋白、牛血清白蛋白或其组合，浓度为0.3％
‑
2.1％；所述促凝剂为聚乙二醇，质量浓度为0.6％
‑
6％；所述解离剂包括含有两个以上羧基的有机酸，浓度为20
‑
230mmol/L，其作用是促进待测样品中脂联素六聚体及以上多聚体解离为脂联素三聚体；所述解离剂淬灭剂包括可溶性钙盐，和/或，可溶性镁盐，浓度为60
‑
440mmol/L，其作用是与所述解离剂结合，使所述解离剂失去解离脂联素六聚体及以上多聚体的能力；所述胶乳颗粒是由苯乙烯和丙烯酸聚合而成的共聚物，表面存在羧基基团，平均粒径范围为60
‑
140nm，所述苯乙烯与丙烯酸的质量比为(1
‑
3)：1；所述脂联素蛋白片段的氨基酸序列为如下，从氨基端开始：GVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGAYGVPGEKGDPGLIGPKGDIGETGIPGHPGPKGA PGRDGVPGTP；所述脂联素单克隆抗体是通过化学交联的方法偶联于胶乳颗粒表面，所用化学交联剂选自EDC、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼、异氰酸钾或其组合；所述包被脂联素蛋白片段的胶乳颗粒在所述第二试剂中的浓度为0.1
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1.1mg/mL；所述包被脂联素单克隆抗体的胶乳颗粒在所述第三试剂中的浓度为1.4
‑
5.6mg/mL。2.根据权利要求1所述脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为1000
‑
7000。3.根据权利要求1所述脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述含有两个以上羧基的有机酸包括乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、柠檬酸、酒石酸、丁二酸中的一种或者几种。4.根据权利要求1所述脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述可溶性钙盐包括氯化钙、硝酸钙、醋酸钙中的一种或者几种，可溶性镁盐包括氯化镁、硝酸镁、醋酸镁中的一种或者几种。5.根据权利要求1所述脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素蛋白片段是通过化学交联的方法偶联于所述胶乳颗粒表面，所用化学交联剂选自EDC、N
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羟基硫代琥珀酰亚胺、N
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羟基琥珀酰亚胺、碳化亚胺、酰肼或其组合。6.一种如权利要求1
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5任一项所述脂联素检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料：缓冲液36
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480mmol/L、
电解质0.1％
‑
1.3％、防腐剂0.08％
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0.45％、表面活性剂0.17％
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3.6％、蛋白稳定剂0.3％
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢强，王贤理，王伊琳，池万余，邓慰，王友群，周招英，
申请(专利权)人：浙江伊利康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：