菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术制造技术

一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，所用的小菇属４种真菌：石斛小菇（Ｍｙｃｅｎａｄｅｎｄｒｏｂｉｉ），紫萁小菇（Ｍｙｃｅｎａｏｓｍｕｎｄｉｃｏｌａ），兰小菇（Ｍｙｃｅｎａｏｒｃｈｉｄｉｃｏｌａ），开唇兰小菇（Ｍｙｃｅｎａａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌａ）；先分别培养菌根真菌和金线莲幼苗，再将菌根真菌与金线莲幼苗共生栽培。采用该项新技术，可大大缩短金线莲的生长周期；提高金线莲产量和有效成分含量。该项技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，生产出的金线莲为绿色产品。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种金线莲菌根栽培技术，具体地说涉及一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，它包括本专利技术所用的菌根真菌、菌根真菌的培养、金线莲芽增殖分化和丛芽形成苗及苗继代的最佳培养基、菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术和对金线莲苗的促生长效果及对金线莲苗有效成分含量的影响。金线莲生于海拔400-1200米之间的阔叶林或针阔叶混交林中，一般生长在通风良好、湿度高、光线较弱的山涧常绿阔叶林下，石壁、沟边、岩缝等阴湿地带。由于该种植物分布范围较窄，储量极为稀少。从1990年开始，福建省科委、教委和林业厅陆续设立专项基金进行金线莲的组织培养及栽培技术研究。目的是为提高金线莲繁殖速度与进行人工栽培奠定基础。试管苗快速繁殖虽然获得了成功，但试管苗出瓶后成活率低、生长缓慢、生长周期长和有效成分含量低成为制约金线莲扩大栽培的主要障碍。为此，目前金线莲仍未大面积人工栽培繁殖。由于金线莲自然生态条件独特，繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，特别是近年来对该植物需求量猛增，产区人们过度采控，使得金线莲野生资源日渐枯竭。在金线莲菌根研究方面，仅江海燕等观察到有真菌侵染金线莲种子的现象；我们在野生金线莲的根中也观察到有真菌的存在，并从该类植物中分离出多种内生真菌。实现金线莲栽培从实验室到工厂化到田间的转化的关键技术，是首先需要解决的问题，而利用菌根技术将金线莲与菌根真菌共生培养，筛选出促进金线莲生长发育有效的优良菌株，对保存金线莲种质资源、提高药效，开辟金线莲大面积栽培繁殖的新途径具有重大理论意义和应用价值。为实现上述目的，本专利技术采用的技术是先分别培养菌根真菌和金线莲幼苗，再将菌根真菌与金线莲幼苗共生栽培，能够完成本专利技术的菌根真菌是一种小菇属(Mycena)真菌，具体为石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)等4种。这4种真菌可以从铁皮石斛、天麻、墨兰和花叶开唇兰获得，于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为0685、0689、0688、0687。具体地说，本专利技术所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本专利技术中所述的比例均为重量百分比)1、菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体或固体培养基；菌根真菌的液体培养为培养基的配制葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后分别接入上述真菌。培养条件培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。菌根真菌的固体培养为培养基的配制阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。本专利技术可以采用上述4种菌根真菌中的任选一种，也可以是由其中任意两种或两种以上菌种组成。2、金线莲苗的培养芽增殖培养基MS(Murashige and Skoog 1968)培养基加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；丛芽增殖培养基MS为基本培养基6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗继代培养基1/2MS，200g/L马铃薯提取液，25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8；3、菌根真菌与金线莲苗共生栽培(1)金线莲栽培基质蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)。其中以泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)为佳。(2)金线莲菌根共生栽培栽培工具各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3厘米厚的基质，其上株行距各5-8厘米栽培一株或2-3株一丛的金线莲苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1厘米大小的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g。使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视金线莲幼苗的高度而定，一般2-3厘米厚。栽后浇放置至室温的自来水即可。(3)栽培条件一般塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴均可采用菌根栽培方法栽培金线莲。栽培金线莲适宜的环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000Lx。(4)金线莲的收获金线莲一般栽后4-6个月收获。收获时即可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质。阴干或60℃以下烘干。本专利技术提供的栽培技术，金线莲生长周期可由传统栽培的12个月缩短到4至6个月；产量提高20-40％；与不接菌根真菌栽培的金线莲苗(对照)相比，该项技术使金线莲苗中总糖含量提高60％，使苗中皂甙含量提高28％；生物碱含量提高1.4倍。(2)液体培养基的配制葡萄糖2.5％；KH2PO40.15％；K2HPO40.1％；MgSO40.15％；天然物麦麸3％(煮汁)。(3)培养条件高压灭菌后分别接入上述真菌，其培养条件培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；温度23℃；培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。2、金线莲芽分化发生过程茎段接种7天即可见节部腋叶对侧生出乳白色颗粒，此为气生根原基；少数茎段节间腋内分化出乳白色颗粒，此为腋芽原基。腋芽与根的最初萌生阶段形态极为相似，均为乳白色颗粒，二者在节部相对而生，这一时期茎段有膨大现象。培养10d时多数茎段节部腋内鼓出乳白色颗粒，有的乳白色颗粒长至圆锥状。腋叶对生的乳白色颗粒伸长成为根。当乳白色颗粒长至3mm左右长、1.5mm左右粗时，顶部出现芽尖，下部长成为浅绿茎，此为主芽。随着主芽茎叶的生长，当主芽具有2-3节时，从其基部节开始分化一级侧芽，其上可发出二级侧芽，二级侧芽上又可再生三级侧芽、四级侧芽。侧芽一般先从上一级芽的最下部节发出，其次是下数第二节部。在分化能力强的培养基中，可出现多级侧芽，且可见多级侧芽同时生长分化，茎尖侧芽的发生早于茎段。3、激素对芽增殖分化的影响MS培养基不能诱导金线莲芽增殖。当培养115天时，在MS(Murashige and Skoog 1968)培养基附加6-BA(6-苄基嘌呤)1.0mg/L时，诱导金线莲茎段、茎尖芽增殖数最多，其主芽及茎尖一般都能产生2-4级分枝。在MS培养基附加6-BA 1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/LNAA诱导的茎段、茎尖芽增殖数最多，分别为对照的3.7倍和3.6倍。截取芽顶部2-2.5cm转接到MS培养基中，10后天即可生根，25天成为完整苗。4、激素对丛芽形成的影响以福建野生金线莲的顶芽、侧芽或休眠芽为材料快速繁殖，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，采用小菇属４种真菌：石斛小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ）、紫萁小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｏｓｍｕｎｄｉｃｏｌａ）、兰小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｏｒｃｈｉｄｉｃｏｌａ）、开唇兰小菇（Ｍｙｃｅｎａ ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌａ）中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下（所述比例均为重量百分比）：（１）菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于ＰＤＡ平皿中，于２５℃恒温培养１２－２０ｄ，分别 在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养；（２）金线莲苗的培养芽增殖培养基：ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ １９６８）培养基，附加６－ＢＡ（６－苄基嘌呤１．２ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ （萘乙酸）０．６ｍｇ／Ｌ；丛芽增殖培养基：ＭＳ为基本培养基，附加６－苄基嘌呤（ＢＡ）１．５ｍｇ／Ｌ，吲哚丁酸（ＩＢＡ）０．６ｍｇ／Ｌ，玉米素（ＺＴ）０．１５ｍｇ／Ｌ；苗继代培养基：１／２ＭＳ，２００ｇ／Ｌ马铃薯提取液，２５ｇ／Ｌ蔗糖 ，琼脂９ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８；（３）菌根真菌与金线莲苗共生栽培（ａ）金线莲栽培基质蛭石∶砂子＝４∶１或森林腐殖土∶砂子＝６∶１或泥炭土∶砂子＝５∶１或泥炭土∶砂子∶蛭石＝４∶１∶２；（ｂ）金线莲菌根共生栽培在硬质材料的托盘 或盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层金线莲栽培基质，其上按株行距栽培一株或一丛的金线莲苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树（山毛榉科Ｆａｇａｃｅａｅ）树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌２ｍｌ或固体菌根真菌１－２ｇ，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖２－３厘米厚，浇放置至室温的水；（ｃ）栽培条件采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为１８－２５℃，光照量为正常日光量的１／３，照度２０００Ｌｘ；（ｄ）金线莲的收获收获时可剪取地上部分，也可 一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或６０℃以下烘干；其中所述的菌根真菌的液体培养为：培养基的配制：葡萄糖 ２．５％；ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ０．１５％；Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］ ０．１％；ＭｇＳＯ↓［４］ ０．１５％；天然物：麦麸３ ％（煮汁），高压灭菌后分别接入上述真菌；培养条件：培养基ｐＨ５．６；三角瓶摇床培养瓶装量５０％；转速１２０转／分钟；２３℃培养...

【技术特征摘要】
1.一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，采用小菇属4种真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、兰小菇(Mycena orchidicola)、开唇兰小菇(Mycena anoectochila)中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下(所述比例均为重量百分比)(1)菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养；(2)金线莲苗的培养芽增殖培养基MS(Murashige and Skoog 1968)培养基，附加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；丛芽增殖培养基MS为基本培养基，附加6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗继代培养基1/2MS，200g/L马铃薯提取液，25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8；(3)菌根真菌与金线莲苗共生栽培(a)金线莲栽培基质蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2；(b)金线莲菌根共生栽培在硬质材料的托盘或盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层金线莲栽培基质，其上按株行距栽培一株或一丛的金线莲苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖2-3厘米厚，浇放置至室温的水；(c)栽培条件采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭顺星，于雪梅，高微微，肖培根，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]