一种产月桂烯工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种产月桂烯工程菌及其构建方法，属于合成生物学技术领域；所述工程菌含有异源

【技术实现步骤摘要】
一种产月桂烯工程菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及一种产月桂烯工程菌及其构建方法，属于合成生物学

。

技术介绍

[0002]月桂烯
(Myrcene)
是一种天然存在于植物精油中的开环单萜，易挥发，不溶于水，易溶于有机溶剂中；无色或淡黄色油状液体；具有令人愉快的
、
清淡的香脂气味
。
月桂烯是重要的工业原料，是多种高价值合成香料的前体，还可用来合成维生素
E
；此外，月桂烯聚合活性高，可以聚合形成性能优良的橡胶材料，具有重要的应用价值
。
[0003]虽然月桂烯存在于植物精油中，但存在量很小，主要利用松节油中
β
‑
蒎烯热裂解产生
。
松节油受限于林业资源产量有限，
β
‑
蒎烯只占一小部分，因此难以获得大量的月桂烯
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是解决月桂烯生物合成产量低的问题，提供一种高产月桂烯的基因工程菌，所述工程菌含有异源
AtoB、HMGS、HMGR、MK、PMK、PMD、idi、trGPPS、trCsMS
基因，其中
AtoB
编码乙酰乙酰辅酶
A
硫解酶的基因，
HMGS
编码
HMG
‑
CoA
合酶的基因，
HMGR
为编码
HMG
‑
CoA
还原酶的基因，
MK
编码甲羟戊酸激酶的基因，
PMK
编码甲羟戊酸
‑5‑
磷酸激酶的基因，
PMD
编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因，
idi
编码异戊二烯焦磷酸异构酶的基因，
trGPPS
为编码香叶基焦磷酸合酶的基因，
trCsMS
编码月桂烯合酶的基因
。
其中
AtoB
，
idi
来自于大肠杆菌
Escherichia coli
，
HMGS
，
HMGR
来自于金黄色葡萄球菌
Staphyl ococcus aureus
，
MK、PMK、PMD
来自于酿酒酵母
Saccharomyces cerevisiae
，
trGPPS
来源于大冷杉
Abies grandis
，
trCsMS
来源于大麻
Cannabis sativa
，出发菌株为大肠杆菌
。
[0005]本专利技术解决上述问题采用的技术方案：一种产月桂烯工程菌含有甲羟戊酸途径基因，香叶基焦磷酸合酶基因及月桂烯合酶基因；所述月桂烯合酶与源于大麻
Cannabis sativa
的月桂烯合酶具有
70
％
、75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％或
99
％同源性的氨基酸序列；所述大麻
Cannabis sativa
的月桂烯合酶的氨基酸序列如下：
[0006]MVVNNSSPSSTIVRRSANYEPPIWSFDYIQSLSTQYKGESYTRQLNKLKKEVKRMLLRMEINSLALLELIDTLQRLGISYHFKNEINTILKKKYNDNYINNNIITNPNYNNLYATALEFRLLRQHGYTVPQEIFNAFKDKRGKFKTSLSDDIMGVLCLYEASFYAMKHENILEEARIFSTKCLKKYMEKIENEEEKKILLLNDNNINSNLLLINHAFELPLHWRITRSEARWFIDEIYEKKQDMNSTLFEFAKLDFNIVQSTHQEDLQHLSRWWRDCKLGGKLNFARDRLMEAFLWDVGLKFEGEFSYFRRTNARLFVLITIIDDIYDVYGTLEELELFTSAVERWDVKLINELPDYMKMPFFVLHNTINEMGFDVLVEQNFVNIEYLKKSWVDLCKCYLQEAKWYYSGYQPTLEEYTELGWLSIGASVILMHAYFCFTNPITKQDLKSLQLQHHYPNIIKQACLITRLADDLGTSSDELNRGDVPKSIQCYMYDNNATEDEAREHIKFLISETWKDMNKKDEDESCLSENFVEVCKNMARTALFIYENGDGHGSQNSLSKERISTLIITPINIPK。
[0007]所述甲羟戊酸途径基因含有如下不同功能的酶：
[0008](a)
使两分子乙酰辅酶
A
缩合形成乙酰乙酰辅酶
A
的酶；
[0009](b)
使乙酰乙酰辅酶
A
与另一分子乙酰辅酶
A
缩合形成3‑
羟
‑3‑
甲基戊二酰辅酶
A
的酶；
[0010](c)
使3‑
羟
‑3‑
甲基戊二酰辅酶
A
转化为甲羟戊酸的酶；
[0011](d)
使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸
‑5‑
磷酸的酶；
[0012](e)
使甲羟戊酸
‑5‑
磷酸转化为甲羟戊酸焦磷酸的酶；
[0013](f)
使甲羟戊酸焦磷酸转化为异戊二烯焦磷酸的酶；
[0014](g)
使异戊二烯焦磷酸转化为二甲基烯丙基焦磷酸的酶
。
[0015]产月桂烯的发酵方法步骤如下：
[0016]从平板上挑取单克隆到
3mL LB
培养基中作为种子液，
37℃
过夜培养后进行转接，按照2％的比例转接到发酵培养基中，转接后在
37℃
培养
9h
，之后向其中加入终浓度
20
μ
M
的
IPTG
进行诱导，并加入
20
％的十二烷，
30℃
发酵
72h
，生产
β
‑
月桂烯
。
[0017]产月桂烯的工程菌的构建方法步骤如下：
[0018]步骤一
、
将编码大麻
Cannabis sativa
月桂烯合酶的异源核酸分子连接到含有异源甲羟戊酸途径的载体上，形成月桂烯表达载体；所述异源核酸分子经过密码子优化，序列如下：
[0019]ATGGTTGTTAACAATAGCAGCCCGAGCAGCACCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种产月桂烯工程菌，其特征在于产月桂烯工程菌含有甲羟戊酸途径基因，香叶基焦磷酸合酶基因及月桂烯合酶基因；所述月桂烯合酶与源于大麻
Cannabis sativa
的月桂烯合酶具有
70
％
、75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％或
99
％同源性的氨基酸序列；所述大麻
Cannabis sativa
的月桂烯合酶的氨基酸序列如下：
MVVNNSSPSSTIVRRSANYEPPIWSFDYIQSLSTQYKGESYTRQLNKLKKEVKRMLLRMEINSLALLELIDTLQRLGISYHFKNEINTILKKKYNDNYINNNIITNPNYNNLYATALEFRLLRQHGYTVPQEIFNAFKDKRGKFKTSLSDDIMGVLCLYEASFYAMKHENILEEARIFSTKCLKKYMEKIENEEEKKILLLNDNNINSNLLLINHAFELPLHWRITRSEARWFIDEIYEKKQDMNSTLFEFAKLDFNIVQSTHQEDLQHLSRWWRDCKLGGKLNFARDRLMEAFLWDVGLKFEGEFSYFRRTNARLFVLITIIDDIYDVYGTLEELELFTSAVERWDVKLINELPDYMKMPFFVLHNTINEMGFDVLVEQNFVNIEYLKKSWVDLCKCYLQEAKWYYSGYQPTLEEYTELGWLSIGASVILMHAYFCFTNPITKQDLKSLQLQHHYPNIIKQACLITRLADDLGTSSDELNRGDVPKSIQCYMYDNNATEDEAREHIKFLISETWKDMNKKDEDESCLSENFVEVCKNMARTALFIYENGDGHGSQNSLSKERISTLIITPINIPK。2.
根据权利要求1所述一种产月桂烯工程菌，其特征在于所述甲羟戊酸途径基因含有如下不同功能的酶：
(a)
使两分子乙酰辅酶
A
缩合形成乙酰乙酰辅酶
A
的酶；
(b)
使乙酰乙酰辅酶
A
与另一分子乙酰辅酶
A
缩合形成3‑
羟
‑3‑
甲基戊二酰辅酶
A
的酶；
(c)
使3‑
羟
‑3‑
甲基戊二酰辅酶
A
转化为甲羟戊酸的酶；
(d)
使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸
‑5‑
磷酸的酶；
(e)
使甲羟戊酸
‑5‑
磷酸转化为甲羟戊酸焦磷酸的酶；
(f)
使甲羟戊酸焦磷酸转化为异戊二烯焦磷酸的酶；
(g)
使异戊二烯焦磷酸转化为二甲基烯丙基焦磷酸的酶
。3.
根据权利要求1所述的一种产月桂烯工程菌，其特征在于产月桂烯的发酵方法步骤如下：从平板上挑取单克隆到
3mL LB
培养基中作为种子液，
37℃
过夜培养后进行转接，按照2％的比例转接到发酵培养基中，转接后在
37℃
培养
9h
，之后向其中加入终浓度
20
μ
M
的
IPTG
进行诱导，并加入
20
％的十二烷，
30℃
发酵
72h
，生产
β
‑
月桂烯
。4.
根据权利要求1所述的一种产月桂烯工程菌，其特征在于：产月桂烯的工程菌的构建方法步骤如下：步骤一
、
将编码大麻
Cannabis sativa
月桂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋辉，陈昶，刘佳佳，姚戈，王馥丽，鲍邵衡，万秀坤，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院防化研究院，
类型：发明
国别省市：