具有热休克蛋白制造技术

描述了利用

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有热休克蛋白90结合结构域的活性诱导型融合蛋白
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求
2021
年2月
12
日提交的美国临时专利申请号
63/149,131
和
2021
年7月
28
日提交的美国临时专利申请号
63/226,554
的优先权，所述临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文
。


[0003]本公开提供了具有热休克蛋白
90(hsp90)
结合结构域的活性诱导型融合蛋白
。
利用可以比
hsp90
更高的亲和力结合
hsp90
结合结构域的药物分子，在翻译后调控融合蛋白的活性
。
在不存在药物分子的情况下，融合蛋白处于失活状态，但在存在药物分子的情况下可被活化
。

技术介绍

[0004]使用基因工程，已经在活化和指导免疫系统的细胞以杀死癌细胞和感染细胞方面取得了显著进展
。
例如，已对
T
细胞进行基因工程改造以表达具有结合特定靶抗原的细胞外组分和当细胞外组分已结合靶抗原时指导
T
细胞作用的细胞内组分的分子
。
例如，细胞外组分可被设计用于结合存在于癌细胞或感染细胞上的靶抗原，并且当结合时，细胞内组分活化
T
细胞以破坏结合的细胞
。
这种分子的实例包括嵌合抗原受体
(CAR)。
[0005]尽管表达
CAR
的
T
细胞可以显示出有效的抗肿瘤活性，但也可能例如由于移植诱导的细胞因子风暴
(
细胞因子释放综合征
)、
肿瘤溶解综合征
(TLS)
和正在进行的
B
细胞血细胞减少而产生显著的毒性，它们中的每一种可归因于组成型表达的和活性的
CAR
的失调的功能输出
。
这种毒性可能会限制基于
CAR
的疗法的适用性
。
[0006]消除
CAR
‑
T
细胞的方法诸如自杀基因介导的这些细胞的消除例如可以减轻这种毒性；然而，该方法具有抗肿瘤活性过早减弱的风险，并且可显著影响治疗潜力
。
因此，需要找到用于在基因改性的免疫细胞表达后控制
CAR
活性的方法
。
[0007]除
CAR
外，具有许多能够控制其活化状态的蛋白质是有益的
。
其他实例包括跨膜受体，诸如传递共刺激或抑制性免疫细胞信号传导的那些
。

技术实现思路

[0008]本公开提供了融合蛋白，其活化状态可通过施用药物分子来控制
。
融合蛋白包含结合药物分子的热休克蛋白
90(hsp90)
结合结构域
。
[0009]本公开的一种示例性融合蛋白是
CAR
，其在体内通过抗原结合而活化的能力通过施用药物分子来控制
。
控制体内表达后活化的能力为基于
CAR
的细胞免疫疗法提供了重要的安全性改善
。
[0010]本公开通过将
hsp90
结合结构域合并到
CAR
的细胞内组分内实现了这些进展
。
在不存在药物分子的情况下，
hsp90
结合结构域被
hsp90
结合，从而防止
CAR
与抗原结合后
CAR
活化所需的其他关键细胞内分子相互作用
。
QUANTI
‑
Luc
合并，并立即在
SpectraMax
上读数
。
在测定前经由流式细胞术获取转导的
Jurkat
‑
DUAL
细胞
。(4A)CD19t(CD19 APC)
和
(4B)EGFRt(
西妥昔单抗
APC)
的流式细胞术分别证实
806EGFR CAR
或
806EGFR
‑
ERT2 CAR
在
Jurkat
‑
DUAL
细胞中的表达
。
[0021]图
5A、
图
5B.Jurkat Dual NF
‑
kB
‑
Luc
报告子测定
。
测量分泌的
Lucia
荧光素酶的终点发光测定
。
以
2:1(5A)
或
1:1(5B)
效应物
:
靶标比率运行测定
。
在运行测定之前，用
K562+EGFRvIII
和设定浓度的4‑
OHT
刺激这些细胞
24
小时
。
两种细胞系均为
80
％ CAR
阳性
。
在测定前
24
小时添加4‑
OHT。
在测定前1天进行
MTX
选择
。
用
806EGFR
‑
ER2T CAR
细胞转导的
Jurkat
‑
DUAL
细胞通过检测与增加的4‑
OHT
水平相对应的增加的分泌的
Lucia
荧光素酶水平来证明
CAR T
细胞的剂量依赖性活化
。
如先前所述，
ERT2
在本文中也可称为
EBD(4
‑
OHT)
并且对应于
SEQ ID NO:13。
[0022]图
6A、
图
6B.S1R1D6。
刺激后培养物
(S1)Mock、806EGFR CAR(6B)
和
806EGFR
‑
ERT2 CAR(6A)T
细胞在
rhIL
‑
2、rhIL
‑
15
和外源
OKT3
抗体的存在下，通过用经辐照的饲养细胞
(20E6 TM
‑
LCL
和
100E6 PBMC)
刺激，以快速扩增方案
(REP)
进行扩增
。
在
REP
的第6天，经由流式细胞术测量
CD4
和
CD8 T
细胞的
CAR
阳性率和百分比
。Mock(40
％ CD4/60...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种嵌合抗原受体
(CAR)
，当由细胞表达时所述
CAR
包含：通过跨膜结构域连接的细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含结合癌抗原或病毒抗原的配体结合结构域，并且所述细胞内组分包含细胞内信号传导结构域和雌激素结合结构域，所述雌激素结合结构域具有选自以下的一组突变：
G521R
；
E353A
；
L384M
和
M421G
；
L384M、M421G
和
G521R
；以及
G400V、M543A
和
L544A。2.
一种活性诱导型融合蛋白，其包含以下的
hsp90
结合结构域和细胞内信号传导结构域：
(i)
共刺激免疫分子或
(ii)
抑制性免疫分子
。3.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域结合药物分子
。4.
如权利要求3所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域以比其结合所述药物分子更低的亲和力结合
hsp90。5.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域包括激素结合结构域
。6.
如权利要求5所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述激素结合结构域是经工程改造的雌激素受体结合结构域
(EBD)。7.
如权利要求6所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述经工程改造的
EBD
包含所述雌激素受体的结合结构域部分和选自以下的一组突变：
G521R
；
E353A
；
L384M
和
M421G
；
L384M、M421G
和
G521R
；或
G400V、M543A
和
L544A。8.
如权利要求7所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述经工程改造的
EBD
具有如
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11
或
SEQ ID NO:13
所示的序列
。9.
如权利要求3所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述药物分子包括小分子雌激素类似物
。10.
如权利要求9所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述小分子雌激素类似物包括他莫昔芬
、
他莫昔芬的盐
、
他莫昔芬的代谢物或结构类似于他莫昔芬的化合物
。11.
如权利要求9所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述小分子雌激素类似物包括他莫昔芬
、4
‑
OHT、
因多昔芬
、ES8
或
CMP8。12.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述活性诱导型融合蛋白是嵌合抗原受体
(CAR)
，当由细胞表达时所述
CAR
包含：通过跨膜结构域连接的细胞外组分和细胞内组分，其中所述细胞外组分包含配体结合结构域，并且所述细胞内组分包含所述共刺激免疫分子的所述细胞内信号传导结构域和所述
hsp90
结合结构域
。13.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述配体结合结构域结合癌抗原或病毒抗原
。
14.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述配体结合结构域包含结合
HER2、CE7、hB7H3、EGFR、EGFRvIII、CD19、CD20、CD22、EphA2、IL13Ra2、L1CAM、oaGD2、B7H3、CD33、
间皮素
、ROR1、FITC
或
VAR2CSA
的
scFv。15.
如权利要求
14
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
scFv
具有如
SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:342
或
SEQ ID NO:43
所示的序列
。16.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述配体结合结构域结合免疫细胞抗原
。17.
如权利要求
16
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述免疫细胞抗原由
B
细胞
、T
细胞
、
自然杀伤细胞
、
自然杀伤
T
细胞
、MAIT
细胞
、
骨髓细胞
、
巨噬细胞
、
单核细胞或树突细胞表达
。18.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述配体结合结构域结合半抗原
。19.
如权利要求
18
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述半抗原包括荧光素
、
漆酚
、
醌
、
生物素或二硝基苯酚
。20.
如权利要求
18
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述配体结合结构域是具有如
SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64
或
SEQ ID NO:65
所示的序列的
scFv。21.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述细胞外组分还包含间隔区
。22.
如权利要求
21
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述间隔区包含
IgG4
铰链
。23.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述细胞内组分还包含
CD3
ζ
细胞内信号传导结构域
。24.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述细胞内信号传导结构域包含4‑
1BB
细胞内信号传导结构域
。25.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述细胞内信号传导结构域包含4‑
1BB
细胞内信号传导结构域，并且其中所述细胞内组分还包含
CD3
ζ
细胞内信号传导结构域
。26.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其还包含与所述
hsp90
结合结构域相邻的
1Gly、2Gly
或
3Gly
接点氨基酸，或不包含与所述
hsp90
结合结构域相邻的接头或接点氨基酸
。27.
如权利要求
26
所述的活性诱导型融合蛋白，其中如果存在的话，所述
1、2
或
3Gly
接点氨基酸位于所述
hsp90
结合结构域的
5'
和所述细胞内信号传导结构域的
3'。28.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域位于所述细胞内信号传导结构域的
3'。29.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域位于所述细胞内信号传导结构域的
5'
和所述跨膜结构域的
3'。
30.
如权利要求
25
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域位于所述
CD3
ζ
细胞内信号传导结构域的
5'
和所述4‑
1BB
细胞内信号传导结构域的
3'。31.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述细胞内组分缺乏接头和接点氨基酸
。32.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述跨膜结构域包括
CD28
跨膜结构域
。33.
如权利要求
12
所述的活性诱导型融合蛋白，其具有如
SEQ ID NO:118
所示的蛋白质序列
。34.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述活性诱导型融合蛋白不包含降解决定子序列
。35.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述共刺激免疫分子包括4‑
1BB、OX40、CD40、CD30、CD27、DR3、SLAMF1、ICOS、GITR、CD25、CD28、CD79A、CD79B、CD226、CARD11、DAP10、DAP12、DR3、FcR
α
、FcR
β
、FcR
γ
、Fyn、Lck、LAT、LRP、LIGHT、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pT
α
、TCR
α
、TCR
β
、TIM1、TRIM、Zap70
或
PTCH2。36.
如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述抑制性免疫分子包括
PD1、PD
‑
L1、PD
‑
L2、CTLA4、TIM3、CEACAM、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD80、CD86、CD160、2B4、B7
‑
H3(CD276)、B7
‑
H4(VTCN1)、KIR、A2aR、MHC I
类
、MHC II
类
、GAL9、
腺苷或
TGFR
β
。37.
一种包含
hsp90
结合结构域的活性诱导型融合蛋白，其中所述活性诱导型融合蛋白缺乏降解决定子序列
。38.
如权利要求
37
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域以比其结合药物分子更低的亲和力结合
hsp90。39.
如权利要求
37
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述
hsp90
结合结构域包括激素结合结构域
。40.
如权利要求
39
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述激素结合结构域是经工程改造的雌激素受体结合结构域
(EBD)。41.
如权利要求
40
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述经工程改造的
EBD
包含所述雌激素受体的结合结构域部分和选自以下的一组突变：
G521R
；
E353A
；
L384M
和
M421G
；
L384M、M421G
和
G521R
；或
G400V、M543A
和
L544A。42.
如权利要求
41
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述经工程改造的
EBD
具有如
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11
或
SEQ ID NO:13
所示的序列
。43.
如权利要求
38
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述药物分子包括小分子雌激素类似物
。44.
如权利要求
43
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述小分子雌激素类似物包括他莫昔芬
、
他莫昔芬的盐
、
他莫昔芬的代谢物或结构类似于他莫昔芬的化合物
。45.
如权利要求
43
所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述小分子雌激素类似物包括他莫昔芬
、4
‑
OHT、
因多昔芬
、ES8
或
CMP8。46.
一种核苷酸，其编码如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白
。47.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其包含如
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14
或
SEQ ID NO:15
所示的编码序列
。
48.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其还包含如
SEQ ID NO:17
所示的编码序列
。49.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其还包含如
SEQ ID NO:79
所示的编码序列
。50.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其还包含如
SEQ ID NO:124
所示的编码序列
。51.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其还包含如
SEQ ID NO:123
所示的编码序列
。52.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其还包含如
SEQ ID NO:122
所示的编码序列
。53.
如权利要求
46
所述的核苷酸，其具有如
SEQ ID NO:125
所示的序列
。54.
一种细胞，其经基因修饰以表达如权利要求2所述的活性诱导型融合蛋白
。55.
如权利要求
54
所述的细胞，其经基因修饰以表达至少两种类型的如权利要求1所述的活性诱导型融合蛋白，其中所述至少两种类型具有结合不同药物分子的不同
hsp90
结合结构域
。56.
如权利要求
55
所述的细胞，其中所述至少两种类型还具有不同的配体结合结构域
。57.
如权利要求
56
所述的细胞，其中所述不同的配体结合结构域结合不同的抗原
。58.
如权利要求
57
所述的细胞，其中所述不同的抗原与共同的癌症
、
共同的感染
、
共同的免疫细胞类型或共同的半抗原相关，或者与不同的癌症
、
不同的感染
、
不同的免疫细胞类型或不同的半抗原相关
。59.
如权利要求
58
所述的细胞，其中所述共同的癌症是急性淋巴母细胞白血病
(ALL)、
急性髓性白血病
(AML)
或脑癌
。60.
如权利要求
54
所述的细胞，其中所述细胞是
T
细胞或自然杀伤
(NK)
细胞
。61.
如权利要求
60
所述的细胞，其中所述
T
细胞是
CD4+
或
CD8+T
细胞
。62.
如权利要求
54
所述的细胞，其中所述细胞是诱导性多能干细胞
(iPSC)、
肿瘤浸润淋巴细胞
(TIL)、
骨髓浸润淋巴细胞
(MIL)、
自然杀伤
T
细胞
(NKT)、
粘膜相关恒定
T(MAIT)
细胞
、
树突细胞
、
单核细胞或巨噬细胞
。63.
一种用于控制体内活性诱导型融合蛋白的活化状态的系统，所述系统包括：所述活性诱导型融合蛋白，其中所述活性诱导型融合蛋白包含结合药物分子的
hsp90
结合结构域以及共刺激免疫分子或抑制性免疫分子的细胞内信号传导结构域；以及所述药物分子
。64.
如权利要求
63
所述的系统，其中所述
hsp90
结合结构域以比其结合所述药物分子更低的亲和力结合
hsp90。65.
如权利要求
63
所述的系统，其中所述
hsp90
结合结构域包括激素结合结构域
。66.
如权利要求
65
所述的系统，其中所述激素结合结构域包括经工程改造的雌激素受体结合结构域
(EBD)。67.
如权利要求
66
所述的系统，其中所述经工程改造的
EBD
包含所述雌激素受体的结合结构域部分和选自以下的一组突变：
G521R
；
E353A
；
L384M
和
M421G
；
L384M、M421G
和
G521R
；或
G400V、M543A
和
L544A。68.
如权利要求
66
所述的系统，其中所述经工程改造的
EBD
具有如
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11
或
SEQ ID NO:13
所示的序列
。69.
如权利要求
63
所述的系统，其中所述药物分子包括小分子雌激素类似物
。70.
如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院以西雅图儿童研究机构名义经营，
类型：发明
国别省市：