核酸特异位点修饰的制造技术

本发明专利技术涉及基于纳米信标的核酸特异位点修饰的电化学发光

【技术实现步骤摘要】
核酸特异位点修饰的ECL检测方法、ECL纳米信标及其制备方法以及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基于纳米信标的核酸特异位点修饰的电化学发光
(ECL)
检测方法
、ECL
检测方法中使用的
ECL
纳米信标及其制备方法
、
以及
ECL
检测方法中使用的试剂盒
。

技术介绍

[0002]核酸，例如
DNA
和
RNA
中存在着大量的化学修饰，这些化学修饰在不改变核酸序列的前提下，作为一种调控机制动态地调节着基因的表达
。
[0003]DNA
甲基化
(DNA methylation)
是一类发生在胞嘧啶5号位碳原子上
、
可稳定遗传的表观修饰，在动
、
植物基因组中广泛存在
。DNA
甲基化在哺乳动物的生长发育过程中广泛参与多种生理过程，包括基因沉默
、
基因印记
(genomic imprinting)、X
染色体失活以及疾病的发生等
。
[0004]部分肿瘤的发生伴随着特定基因的高甲基化事件，而且基因局部的高甲基化事件早于细胞的恶性增生发生，因此特定基因的甲基化水平的检测可作为肿瘤早期预测和诊断的重要依据之一
。
例如，早期的结直肠癌
(CRC)
筛查检测即是基于表观遗传的生物标志物进行的，
FDA
已批准通过检测特定基因启动子
CpG
甲基化的增加来进行
CRC
的早期筛查和辅助诊断
(
参见非专利文献
1)。
另外，不同肿瘤类型发生高甲基化的抑癌基因不同，例如卵巢癌中，抑癌基因
RASSF1A、BRCA1、APC、CDKN2A
等呈高甲基化状态，乳腺癌中，抑癌基因
PCDHB15、WBSCR17、IGF1、GYPC
等呈高甲基化状态
(
参见非专利文献
2)。
通过对这些特定抑癌基因甲基化水平进行检测，不仅可加强特定肿瘤的筛查和诊断，而且也有助于肿瘤针对性治疗效果的评估以及预后观察
。
[0005]目前
DNA
甲基化检测的标准方法是亚硫酸氢盐处理，具体而言，通过用亚硫酸氢盐
、
例如亚硫酸氢钠处理
DNA
，可以将
DNA
中的胞嘧啶
(C)
转化为尿嘧啶
(U)
，但是发生了甲基化的5‑
甲基胞嘧啶
(5
‑
mC)
则保持不变，由此通过随后的
PCR
或测序即可将5‑
mC
与
C
区分开，从而实现对甲基化
DNA
的检测
。
[0006]但是，亚硫酸氢盐处理需要在严格的化学和温度条件下进行核酸预处理，且
PCR
或测序检测操作复杂，需要专业技术人员以及专业设备，使得该检测方法效率低
、
耗时长
、
成本高
。
因此，迫切需要发展简单
、
快速
、
灵敏的甲基化
DNA
检测方法
。
[0007]近期，基于特异性抗体对甲基化位点识别的甲基化
DNA
检测方法引起了关注
。
这类检测方法不需要核酸预处理，且可以通过对特异性抗体标记不同信标，进行电化学
(
例如非专利文献
3)、
荧光等检测
。
[0008]近年发展起来的
ECL
技术已在生物分析，例如肿瘤蛋白标记物检测方面得到广泛应用
(
例如非专利文献
4)。ECL
技术是利用电化学原理在电极表面进行电化学反应产生激发态而引发特异性发光的方法
。
由于
ECL
是电致发光，相对于荧光而言，不需要外加激发光源且没有光漂白和光干扰等影响，因此具有设备简单
、
成本低廉
、
背景信号低
、
检测灵敏度高等优点
。
[0009]但是，到目前为止，现有技术中尚没有可行的
、
令人满意的用于核酸特异性位点修饰检测的
ECL
检测方法
。
[0010]现有技术文献
[0011]非专利文献
[0012]非专利文献1：
Yvette N Lamb et al.
，
Epi proColon2.0 CE
：
A Blood
‑
Based Screening Test for Colorectal Cancer
，
Mol Diagn Ther.2017 Apr
；
21(2):225
‑
232
[0013]非专利文献2：洪婷婷，
DNA
表观遗传修饰的特异性检测，武汉大学，
2017
年，博士学位论文
[0014]非专利文献3：
Eloy Povedano et al.
，
Amperometric Bioplatforms To Detect Regional DNA Methylation with Single
‑
Base Sensitivity
，
Anal.Chem
，
2020
，
92
，
5604
‑
12
[0015]非专利文献4：
Xiaoming Zhou et al.
，
Synthesis,labeling and bioanal ytical applications of a tris(2,2`
‑
bipyridyl)Ruthenium(II)
‑
based electroc hemiluminescence probe
，
Nat Protoc 2014 May
；
9(5)

技术实现思路

[0016]本专利技术所要解决的课题
[0017]本专利技术的目的在于提供一种对核酸特异位点修饰进行简单
、
灵敏
、
快速且通用的电化学发光检测方法
。
另外，本专利技术还提供上述检测方法中所使用的电化学发光纳米信标及其制备方法
、
以及上述检测方法中所使用的试剂盒
。
[0018]用于解决课题的手段
[0019]本申请的专利技术者们针对上述课题进行了大量...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种电化学发光纳米信标的制备方法，其包含下述工序：将金属配合物离子掺杂到无机氧化物纳米粒子上，得到金属掺杂无机氧化物纳米粒子；和将二抗结合到所述金属掺杂无机氧化物纳米粒子上，得到二抗修饰了的金属掺杂无机氧化物纳米粒子，所述二抗识别核酸特异位点修饰的特异性抗体
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子为二氧化硅纳米粒子
、
二氧化钛纳米粒子
、
氧化锌纳米粒子
、
或氧化铁纳米粒子
、
或者包覆有二氧化硅
、
二氧化钛
、
氧化锌或氧化铁的纳米粒子
。3.
根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子为二氧化硅纳米粒子
。4.
根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述二抗是针对所述特异性抗体的通用部分进行识别的蛋白
。5.
根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述金属配合物离子为三
(
联吡啶
)
钌
(II)
配合物离子
(Ru(bpy)
32+
)。6.
一种电化学发光纳米信标，其是通过权利要求1～5所述的制备方法制备的
。7.
一种基于纳米信标的核酸特异位点修饰的电化学发光检测方法，其包含下述工序：工序1：以修饰有捕获核酸的磁性微粒为反应试剂1与待测样品混合，对样品中的目标核酸修饰进行识别捕获；工序2：以核酸特异位点修饰的特异性抗体为反应试剂2对目标核酸的特异位点修饰进行捕获标记；工序3：以权利要求6所述的电化学发光纳米信标为反应试剂3对工序2中得到的磁性微粒
‑
捕获核酸
‑
目标核酸
‑
特异性抗体复合物进行检测信号标记；和工序4：将工序3中得到的磁性微粒
‑
捕获核酸
‑
目标核酸
‑
特异性抗体
‑
纳米信标复合物置于电极表面，加入共反应剂后进行电化学发光检测，根据电化学发光信号有无和强度对所述目标核酸进行定性与定量分析
。8.
根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述核酸为
DNA
或
RNA。9.
根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄昊，许奇齐，吴小天，鞠熀先，吴洁，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：