一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和检测领域，具体为一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条及其制备方法和应用

【技术实现步骤摘要】
一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和检测领域，具体为一种检测鳜虹彩病毒抗体胶体金试纸条的制备方法及其应用
。

技术介绍

[0002]虹彩病毒最初在昆虫体内发现，后来从爬行动物
、
鱼类
、
软体动物
、
原虫
、
乃至藻类和植物体内分离到了虹彩病毒
。
多数虹彩病毒是非致病性的，有些虹彩病毒可引起鱼类的疾病，危害比较大
。
[0003]鳜鱼是传统的食用鱼类，养殖周期短
、
经济效益高
。
虹彩病毒对鳜鱼养殖危害很大，尤其是传染性脾肾坏死病毒
ISKNV
，会引起鳜鱼爆发性死亡，严重危害鳜鱼养殖产业的发展
。
感染虹彩病毒的鳜鱼体表症状不明显或者口腔周围
、
鳃盖
、
鳍条基部
、
尾柄处充血
。
有的病鱼眼球突出，有蛀鳍现象
。
解剖可见肝脏
、
脾脏和肾脏肿大，并有出血点，肠壁充血或出血，肠内充满黄色粘稠物
。
[0004]一般检测鳜虹彩病毒的方法是通过酶联免疫标记
、
免疫荧光技术
、
免疫胶体金电镜技术等，对其抗体进行检测
。
这些方法具有高灵敏度
、
强特异性，可用于定性或半微量
、
微量和超微量定量分析
。
然而，在实际应用中，上述免疫实验需要专业人员进行操作，并且对特异性抗体的要求高，检测仪器设备比较复杂，检测时间长
。
这些弊端的存在体现了快速简便的临床检测方法开发的必要性和重要性
。
同时，由于试纸条的样品孔中滴加的样品为鳜鱼的全血样品，如果操作速度慢导致凝血，可能会出现液体不能充分层析到试纸条顶部，从而出现试纸条无效现象
。
[0005]胶体金免疫层析试验
(GICA)
使用硝酸纤维素膜
(NC)
作为载体，胶体金标记的抗原或抗体作为示踪剂
。
胶体金免疫层析试纸条具有价格低廉
、
操作简便
、
检测快捷和特异性强的优点，这种检测已被用于新冠肺炎病毒抗原的诊断
。
目前，
GICA
技术已被广泛应用于妊娠检测
、
病原体抗体和抗原检测
、
疾病相关的蛋白检测等
。GICA
技术已经成为目前动物医学快速检测中最快速
、
敏感的免疫学检测方法之一
。
该技术中免疫复合物将被截留或富集在检测带上，标记物
(
胶体金
)
会呈现直观的显色试验现象
。
若样品中不含待检测物，则会同游离标记物一起到达质控线
。
[0006]需要对现有技术加以改进，不用对样品进行处理，实现以全血或血清为样本，快速便捷地检测鳜虹彩病毒，对于水产养殖的病害防控具有重要意义
。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在克服现有技术中的不足，提供一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条
。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供利用上述试纸条检测鳜虹彩病毒或鳜虹彩病毒抗体的方法
。
[0009]一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条，包括依次重叠的样品垫
、
结合垫
、
硝酸纤维素膜和吸水垫；
[0010]样品垫用
pH
＝
7.3
‑
7.5、
含
0.15
％
‑
0.25
％ TritionX
‑
100
的
PBS
缓冲液预处理；结合垫用
pH
＝
7.3
‑
7.5、
含
1.5
％
‑
2.5
％ Tween
‑
20、4
％
‑6％海藻糖的
PBS
缓冲液预处理；
[0011]结合垫承载胶体金标记的
MCP
蛋白；
[0012]硝酸纤维素膜上设置检测线和质控线，检测线用
Protein A
标记，质控线用
MCP
多克隆抗体标记
。
所述的
MCP
多克隆抗体为兔源
MCP
多克隆抗体
。
[0013]胶体金颗粒的平均粒径为
20nm
左右，最大吸收峰对应的
OD
值大于
0.8
，本专利技术的一个优选方式中，最大吸收峰对应的
OD
值大于
0.9。
[0014]结合垫中，胶体金与
MCP
蛋白的质量比为
50
‑
90
：1，优选为
50
‑
75
，在本专利技术的一个优选方式中，为
55
‑
60
：
1。
[0015]所述胶体金的制备方法为：浓度为
0.005wt
％
‑
0.015wt
％的氯金酸溶液煮沸加入柠檬酸三钠，搅拌并加热至溶液为紫红色，继续加热5‑
15min。
氯金酸与柠檬酸三钠的质量比为1：1‑3，优选为1：
2。
[0016]检测线上的
Protein A
含量为
0.8
‑
1.2
μ
g/cm
，优选为1μ
g/cm。
[0017]质控线上的
MCP
多克隆抗体含量为
0.5
‑
0.7
μ
g/cm
，优选为
0.6
μ
g/cm。
[0018]上述胶体金侧流免疫试纸条的制备方法，包括如下步骤：
[0019](1)
结合垫和样品垫分别预处理，并在硝酸纤维素膜上划质控线和检测线，经过预处理的结合垫用金标抗原溶液浸润并烘干；
[0020]所述结合垫的预处理方法为：将结合垫用
pH
＝
7.3
‑
7.5、
含
1.5
％
‑
2.5
％
Tween
‑
20、4
％
‑6％海藻糖的
PBS
缓冲液浸泡并烘干；
[0021]所述样品垫的预处理方法为：将样品垫用
pH
＝
7.3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条，包括依次重叠的样品垫
、
结合垫
、
硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，样品垫用
pH
＝
7.3
‑
7.5、
含
0.15
％
‑
0.25
％
TritionX
‑
100
的
PBS
缓冲液预处理；结合垫用
pH
＝
7.3
‑
7.5、
含
1.5
％
‑
2.5
％
Tween
‑
20、4
％
‑6％海藻糖的
PBS
缓冲液预处理；结合垫承载胶体金标记的
MCP
蛋白；硝酸纤维素膜上设置检测线和质控线，检测线用
Protein A
标记，质控线用
MCP
多克隆抗体标记
。2.
根据权利要求1所述的胶体金侧流免疫试纸条，其特征在于，结合垫中，所述胶体金颗粒的平均粒径为
20nm
，最大吸收峰对应的
OD
值大于
0.8。3.
根据权利要求1所述的胶体金侧流免疫试纸条，其特征在于，结合垫中，所述胶体金与
MCP
蛋白的质量比为
50
‑
90
：
1。4.
根据权利要求1所述的胶体金侧流免疫试纸条，其特征在于，检测线上的
Protein A
含量为
0.8
‑
1.2
μ
g/cm
，质控线上的
MCP
多克隆抗体含量为
0.5
‑
0.7
μ
g/cm。5.
根据权利要求1所述的胶体金侧流免疫试纸条，其特征在于，所述胶体金的制备方法为：浓度为
0.005wt
％
‑
0.015wt
％的氯金酸溶液煮沸加入柠檬酸三钠，搅拌并加热至溶液为紫红色，继续加热5‑
15min
；氯金酸与柠檬酸三钠的质量比为1：1‑
3。6.
权利要求1‑5任一项所述的胶体金侧流免疫试纸条的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)
结合垫和样品垫分别预处理，并烘干；并...

【专利技术属性】
技术研发人员：计晓花，吕利群，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：