一种基于金纳米壳的比色制造技术

本发明专利技术公开一种

【技术实现步骤摘要】
一种基于金纳米壳的比色/光热/拉曼多模式侧流免疫分析检测方法


[0001]本专利技术涉及一种
Au
纳米壳探针用于多模式侧流免疫分析检方法，其特征在于利用
Au
纳米壳优异的局域表面等离子共振
(LSPR)
与表面增强拉曼散射效应
(SERS)
高特异性通过比色
、
拉曼
、
光热多模式高特异性定量分析检出
SARS
‑
CoV
‑2中和抗体
。

技术介绍

[0002]严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型，又称为
(SARS
‑
CoV
‑2或
COVID
‑
19)
是一种具有包膜的
、
不分节段的正链单股
RNA
病毒，颗粒呈现圆形或椭圆形，直径为
80
至
120
纳米，属于网巢病毒目冠状病毒科
。
病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，它造成了于
2019
年底暴发的
2019
冠状病毒病
(COVID
‑
19)。SARS
‑
CoV
‑2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的
ACE2
为受体达到感染，主要感染的器官包括肺部
、
心脏
、
肾脏等多个器官
。SARS
‑
CoV
‑2病毒进入人体后，会引起先天免疫系统的免疫应答
。SARS
‑
CoV
‑2中和抗体通过与病原体结合来阻断病毒的细胞浸润和复制过程，从而防止
SARS
‑
CoV
‑2病毒感染
。
使用恢复期患者血液中的中和抗体实施
SARS
‑
CoV
‑2治疗是一种重要的诊疗方法
。SARS
‑
CoV
‑2病毒
S
蛋白的受体结合结构域片段
(RBD)
在病毒浸润细胞过程中至关重要，利用针对
SARS
‑
CoV
‑
2RBD
的抗体可能对恢复期患者具有保护作用
。
许多疫苗会诱导产生中和抗体，从而有效阻断宿主细胞上
RBD
与人细胞上
ACE
‑2蛋白之间的相互作用
。
这些中和抗体的水平可作为评估免疫保护有效性的重要参数，还能够开发针对
SARS
‑
CoV
‑2的疫苗策略，特别是在未来定期重新接种针对新的病毒变体的疫苗，例如
Delta
和
Omicron
变体
。
[0003]传统的检测人体内抗体的方法包括沉淀反应
、
凝集试验补体结合试验；近年主流的方法有标记免疫测定
,
如酶联免疫测定
、
荧光免疫测定
、
发光免疫测定等
(W.Liu,et al.J.Clin.Microbiol.,58(6)(2020),p.e00461
；
Q.Liu,et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,12(4)(2020),pp.4358
‑
4365
；
X.F.Cai,et al.J.Infect.Dis.,222(2)(2020),pp.189
‑
193)。
这些经典的检测方法具有较为出色的检出灵敏度，并且已经被实践证实其实用性
。
但是以上的方法，缺点也很明显，一方面，这些方法需要大型仪器和专业的操作人员，难以大范围推广实现快速实施检测；另一方面，上述方法检测时间往往很长，不利于现场的快速检出
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对即时现场检测中抗体检测耗时长
、
费人力
、
成本高
、
无法定量等不足，以
Au
纳米壳作为侧流免疫分析的标记物，提供一种基于金纳米壳的比色
/
光热
/
拉曼多模式侧流免疫分析检测方法
。
[0005]所述
Au
纳米壳探针是具有空心球壳结构的球形纳米粒子，使用
Ag
纳米粒子作为刻蚀模板制备
Au
纳米壳，厚度为
5.1
～
7.1nm
，并以新冠病毒为实施例进行检测
。
[0006]所述
Au
纳米壳的制备方法和试纸条的组装喷涂，包括以下步骤：
[0007]1)Ag
种子的制备：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，搅拌加热并保持一段时间，然后加入硝酸银溶液后，快速加入新鲜配制的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌下保持一段时间
。
溶液将由无色转变为黑色，最后转变为棕黄色，即得到银种子溶液
。
[0008]2)
制备
Ag
溶胶：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，回流煮沸并保持一段时间后，依次加入银种子与硝酸银溶液，继续回流煮沸，加入柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液，回流一段时间后再次加入柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液，回流一段时间后冷却至室温，放入紫外暗箱中进行熟化，即得到银溶胶
。
[0009]3)
制备
Au
纳米壳：向三口烧瓶中加入银溶胶和聚乙烯吡咯烷酮溶液，回流加热至一定温度后，缓慢加入氯金酸溶液
。
反应过程中每隔一段时间抽取少量反应溶液进行紫外可见光吸光度的检测，当吸收峰达到特定波长后移至冰水浴中终止反应
。
用超纯水离心洗涤三次后，加入
MBA
的乙醇溶液，剧烈搅拌反应一段时间
。
离心洗去游离的
MBA
并将其重新分散在水中
。
[0010]4)Au
纳米壳表面修饰巯基聚乙二醇羧基
(HS
‑
PEG
‑
COOH)
：取
Au
纳米壳溶液，加入巯基聚乙二醇羧基溶液，在一定温度下剧烈搅拌
。
并用
PBS
离心洗涤三次
。
[0011]5)
缀合蛋白制备免疫功能化
Au
纳米壳
(INSs)
：向修饰了巯基聚乙二醇羧基的
Au
纳米壳加入一定量的
EDC(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基
)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐
)
和
NHS(N...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于金纳米壳的比色
/
光热
/
拉曼多模式侧流免疫分析检测方法，其特征在于具体方法如下：取
20
μ
LINSs
探针溶液加入微孔板中，随后加入
20
μ
L
已知浓度的样品溶液和
10
μ
L
运行溶液，使所有混合溶液混合均匀，在常温下反应
15min
后将试纸条的样品垫一端浸没在微孔板内的溶液中；常温下等待
15min
，观察试纸条上显色带的颜色变化；同时，利用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以
1075cm
‑1处的光谱强度变化为纵坐标，中和抗体浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到拉曼线性方程；利用功率为
2W
，光照面积为1×
1cm2的激光照射检测线，以
5s
内检测线处温度提升的程度为纵坐标，中和抗体浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到光热线性方程
。
用相同的方法得到检测结果
。
观察检测线处颜色，与检测标准溶液的试纸条对比，可对中和抗体浓度进行班定量检测；同时，记录下检测线上的拉曼强度，与工作曲线对比，带入拉曼线性方程，即可求得中和抗体的浓度；记录下检测线上
5s
内检测线处温度提升的程度，与工作曲线对比，带入光热线性方程，即可求得中和抗体浓度
。2.
如权利要求1所述一种基于金纳米壳的比色
/
光热
/
拉曼多模式侧流免疫分析检测方法，其特征在于所述的新冠病毒中和抗体标准溶液浓度依次为
0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5
μ
g/mL
；运行溶液为含有
0.5wt
％牛血清白蛋白
、1.5wt
％
Tween
‑
20
的
pH
＝
7.4
的
PBS
缓冲溶液
。3.
如权利要求1所述一种基于金纳米壳的比色
/
光热
/
拉曼多模式侧流免疫分析检测方法，其特征在于
Au
纳米壳探针的合成步骤和试纸条的制作步骤包括以下过程：
1)Ag
种子的制备：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，搅拌加热并保持一段时间，然后加入硝酸银溶液后，快速加入新鲜配制的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌下保持一段时间
。
溶液将由无色转变为黑色，最后转变为棕黄色，即得到银种子溶液；
2)
制备
Ag
溶胶：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，回流煮沸并保持一段时间后，依次加入步骤
1)
制备的银种子与硝酸银溶液，继续回流煮沸，加入柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液，回流一段时间后再次加入柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液，回流一段时间后冷却至室温，放入紫外暗箱中进行熟化，即得到银溶胶；
3)
制备
Au
纳米壳：向三口烧瓶中加入步骤
2)
制备的银溶胶和聚乙烯吡咯烷酮溶液，回流加热至一定温度后，缓慢加入氯金酸溶液
。
反应过程中每隔一段时间抽取少量反应溶液进行紫外可见光吸光度的检测，当吸收峰达到特定波长后移至冰水浴中终止反应
。
用超纯水离心洗涤三次后，加入
MBA
的乙醇溶液，剧烈搅拌反应一段时间
。
离心洗去游离的
MBA
并将其重新分散在水中；
4)Au
纳米壳表面修饰巯基聚乙二醇羧基
(HS
‑
PEG
‑
COOH)
：取步骤
3)
制备的
Au
纳米壳溶液，加入巯基聚乙二醇羧基溶液，在一定温度下剧烈搅拌
。
并用
PBS
离心洗涤三次；
5)
缀合蛋白制备免疫功能化
Au
纳米壳
(INSs)
：向步骤
4)
制备的修饰了巯基聚乙二醇羧基的
Au
纳米壳加入一定量的
EDC(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基
)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐
)
和
NHS(N
‑
羟基琥珀酰亚胺
)
溶液，在室温下摇晃一段时间
。
使用
PBS
离心洗涤三次
。
向活化后的溶液加入适量的新冠病毒
S
蛋白，在剧烈振荡下反应一段时间并在适宜条件下放置过夜，使用
PBS
离心洗涤三次并分散在重悬浮液中，得到免疫功能化
Au
纳米壳
(INSs)
；
6)
试纸条组装及喷涂：试纸条由
PVC
基板
、
样品垫
、
结合垫
、
硝酸纤维素膜
、
吸水垫组合粘贴合成
。
在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂
ACE 2
蛋白作为检测线
(T
线
)
和小鼠抗新
冠病毒
S<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭庚辰，李佳康，田张裕，曾景斌，付春辉，边宏宇，梁鹏辉，矫春鹏，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：