一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选技术及其应用


[0001]本专利技术属于基因突变和基因工程
，具体涉及一种基于
CRISPR
核酸检测系统的高效抗病毒靶点筛选技术及其应用
。

技术介绍

[0002]流行性感冒，简称流感，是由流感病毒
(Influenza virus)
引起的一种急性呼吸道传染病
。
全球性的流感大流行危害尤为严重，每年约数十万人死于流感及其导致的并发症，而主要造成感染和死亡的病毒为甲型流感病毒
(Influenza A virus,IAV)。IAV
极易变异，亚型众多并且能够跨越动物
‑
人类宿主物种屏障，曾引起多次流感大流行，给人类健康问题带来严重威胁
。
目前流感的预防主要依靠流感疫苗的接种，由于流感病毒易发生抗原漂移以及抗原转换，疫苗保护效力具有很强的时效性
。
近年来研究人员开发出了一系列高效的抗流感病毒药物，然而随着流感病毒逐年的变异以及耐药株的出现，抗流感病毒药物的研发面临严峻的挑战
。
因此，建立一种可有效应对病毒变异及耐药突变的抗病毒药物快速研发平台势在必行
。
[0003]近年来，
CRISPR
基因编辑技术迅猛发展，基于
CRISPR/Cas9
系统的基因编辑技术作为一种高效可编程的基因改造工具已在医学
、
生物学
、
农业等领域被广泛用于科学研究
、
基因治疗以及动植物育种等研究
。2017
年，研究人员发现了可以靶向
RNA
的
CRISPR/Cas13
系统并将其应用于核酸检测
、RNA
编辑以及抗病毒等领域
。
在抗病毒方面，目前研究人员已在细胞及体内利用
CRISPR/Cas13
技术实现对多种
RNA
病毒的高效抑制
。
研究结果表明，该技术不仅具有可编程
、
高效
、
低脱靶等优势，还可同时靶向多种病毒亚型以防止耐药株的逃逸
。
然而现有
CRISPR/Cas13
系统抗病毒技术在筛选靶点时过程繁琐且耗时长
、
成本高，限制了高效抗病毒靶点的筛选及技术的推广应用
。
考虑到
CRISPR/Cas13
系统已被开发为一种高灵敏
、
高特异
、
高通量的体外核酸检测技术，而其在体外的核酸检测原理与细胞内抗病毒原理类似，均依赖于
crRNA
与
Cas
蛋白和目标核酸的特异性结合并激活
Cas13
蛋白
RNA
酶活性的能力，为了进一步推动
CRISPR/Cas13a
系统在抗病毒领域的应用，因此，本研究以流感病毒为例，旨在建立一种基于
CRISPR/Cas13a
核酸检测系统的抗流感病毒
crRNA
靶点高效筛选技术，筛选出具有高效抗流感病毒活性的
crRNA
，同时为基于
CRISPR/Cas13a
系统的可编程抗病毒靶点筛选提供新策略
。

技术实现思路

[0004]基于现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于检测甲型流感病毒基因的
CRISPR
‑
Cas13a
系统；
[0005]所述用于检测甲型流感病毒各区段的
CRISPR
‑
Cas13a
系统包括如下
a1)
‑
a2)
；
[0006]a1)RT
‑
PCR
引物对和
crRNA
；
[0007]所述
RT
‑
PCR
引物对
、crRNA
的靶点序列如表
1、
表
3、
表8，
[0008]表
3、
表8中序列第1‑
38
位均为用于与
Cas13a
蛋白结合的锚定序列；第
39
‑
66
位均为靶向甲型流感病毒各区段靶点序列的向导序列
。
[0009]用于扩增待测样本靶点序列的
RT
‑
PCR
扩增引物，且所述
RT
‑
PCR
扩增引物中的一条引物的
5'
末端具有被
T7 RNA
聚合酶识别的区域；
[0010]a2)crRNA
和
LwCas13a
蛋白，或
crRNA
和
LwCas13a
蛋白复合体；
[0011]所述
crRNA
包括用于与
Cas13a
蛋白结合的锚定序列和靶向甲型流感病毒位点靶点序列的向导序列；
[0012]所述靶点序列位于分别位于甲型
H1N1
流感病毒编码
PA(GenBank ID
：
NC_002022.1)、PB1(GenBank ID
：
NC_002021.1)、PB2(GenBank ID
：
NC_002023.1)、NP(GenBank ID
：
NC_002019.1)、NS(GenBank ID
：
NC_002020.1)
蛋白的序列上；
[0013]所述
crRNA
序列如表
6、
表9所示
。
[0014]上述
CRISPR
‑
Cas13a
系统中，所述
Cas13a
蛋白为
LwCas13a
蛋白
。
[0015]本专利技术第二个目的是提供一种抑制流感病毒的
CRISPR
‑
Cas13a
系统
。
[0016]本专利技术提供的
CRISPR
‑
Cas13a
系统，包括
Cas13a
蛋白和靶向甲型流感病毒的靶点对应的
crRNA
，或二者形成的复合体；
[0017]上述
CRISPR
‑
Cas13a
系统中，所述甲型流感病毒的各基因靶点为序列
30
‑
34。
[0018]进一步的提供相应的应用：
[0019]上述的系统在制备抑制流感病毒产品中的应用；
[0020]上述
CRISPR
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种抑制甲型流感病毒的
CRISPR
‑
Cas13a
系统，包括
Cas13a
蛋白和甲型流感病毒的各基因靶点对应的
crRNA
，或二者形成的复合体
。2.
根据权利要求1所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统，其特征在于：所述甲型流感病毒的基因靶点序列选自
SEQ ID NO.30
‑
34
中的一种或多种
。3.
根据权利要求1或2所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统，其特征在于：所述2型流感病毒的基因靶点对应的
crRNA
序列选自
SEQ ID NO.1
‑
29
中的一种或多种
。4.
权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备抑制流感病毒产品中的应用
。5.
权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备降低流感病毒载量产品中的应用
。6.
权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备流感病毒疫苗中的应用；或权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备抑制流感病毒产品中的应用；或权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备降低流感病毒载量产品中的应用；或权利要求1‑3中任一所述的
CRISPR
‑
Cas13a
系统在制备抗流感病毒产品中的应用
。7.
一种
RNA
片段，其核苷酸序列为
SEQ ID NO.1
‑
29
中的一种或多种
。8.
权利要求7所述的
RNA
片段在制备抑制流感病毒产品中的应用；或权利要求7所述的
RNA
片段在制备降低流感病毒载量产品中的应用；或权利要求7所述的
RNA
片段在制备流感病毒疫苗中的应用；或权利要求7所述的
RNA
片段在制备抗流感病毒产品中的应用
。9.
根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒
。10.
权利要求7所述的
RNA
片段和
Cas13a
蛋白或二者形成的复合体在如下
1)
‑
4)
至少一种中的应用：
1)
制备抑制流感病毒复制的产品；
2)
制备降低流感病毒载量产品；
3)
制备流感病毒疫苗；
4)
制备抗流感病毒产品
。11.
一种基于
CRISPR/Cas13a
核酸检测系统的抗病毒
crRNA
靶点高效筛选方法，其特征在于，其包含以下步骤：
(1)
设计
crRNA 和
PCR
引物；
(2)
利用
RT
‑
RCR
技术对目标核酸进行扩增，将目标病毒检测的靶点序列转录得到相应的
ssRNA
，用步骤
(1)
的
crRNA
进行检测，比较不同
crRNA
的信号强弱，选择荧光信号较强且灵敏度高的
crRNA
；
(3)
将步骤
(1)
的
crRNA
用于病毒感染和
CRISPR
‑
Cas13a

【专利技术属性】
技术研发人员：孙岩松，李浩，韩尧，张友萃，杨兰，依文彦博，董雪，牛梦伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：