定量表达制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及定量表达

【技术实现步骤摘要】
定量表达Alyref手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及定量表达
Alyref
手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒中的应用
。

技术介绍

[0002]造血干细胞功能降低是血液系统衰老的主要原因，导致与年龄相关的造血系统变化的发生，例如：贫血
、
免疫衰老以及血液系统恶性肿瘤的发生
。
虽然目前已报道造血干细胞衰老发生的分子机制，包括
DNA
损伤和
DNA
复制压力
、
端粒受损
、
线粒体功能障碍和氧化损伤
、
表观遗传修饰改变
、
蛋白质稳态失衡
、
细胞极性改变等
。
但是如何使衰老造血干细胞年轻化目前仍是悬而未决的科学难题
。

技术实现思路

[0003]本专利技术旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一
。
为此，本专利技术提供一种定量表达
Alyref
手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒的应用，通过定量表达
Alyref
可以促进衰老造血干细胞细胞核内贮积的
RNA
出核转运，并且改善衰老造血干细胞自我更新能力，定量表达
Alyref
可以延缓血液系统衰老
。
[0004]本专利技术提供一种定量表达
Alyref
手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒的应用
。
[0005]进一步地，通过构建定量表达
Alyref
的载体实现定量表达
Alyref
手段，所述定量表达
Alyref
的载体的序列为
SEQ ID NO .1。
进一步地，所述定量表达
Alyref
的载体的构建方法包括：把
k
‑
turn
序列
、L7Ae
以及小鼠
Alyref cDNA
插入到
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体内，其中1个所述定量表达
Alyref
的载体中包括2个
k
‑
turn
序列片段
、1
个
L7Ae
片段以及1个小鼠
Alyref cDNA
片段；
[0006]其中，所述
k
‑
turn
序列为
SEQ ID NO .2
，所述
L7Ae
的序列为
SEQ ID NO .3
，所述小鼠
Alyref cDNA
的序列为
SEQ ID NO .4
，所述
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体的序列为
SEQ ID NO .5。
[0007]进一步地，所述定量表达
Alyref
的载体的构建方法包括：利用
SalI
内切酶和
BamHI
内切酶对所述
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体进行双酶切，得到线性化载体；将
k
‑
turn
序列
、L7Ae
以及小鼠
Alyref cDNA
和所述线性化载体混合进行重组反应，得到所述定量表达
Alyref
的载体
。
[0008]进一步地，所述双酶切反应包括：将2μ
g pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体
、1
μ
L SalI
内切酶
、1
μ
L BamHI
内切酶和5μ
L CutSmart 缓冲液混合，补充水至
50
μ
L
混匀后，在
37℃
水浴装置中酶切
3h
，将所述产物置于
65℃
灭活
20min
后进行琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体
。
[0009]进一步地，所述重组反应包括：将
50
‑
100ng
所述线性化载体
、10ng
插入片段
、2
μ
L 5
×
CE II 缓冲液
、1
μ
L Exnase II
混合，补充水至
10
μ
L
混匀后在
37℃
水浴装置中重组
30min
，所述插入片段中
k
‑
turn
序列
、L7Ae
以及小鼠
Alyref cDNA
片段的数量比为
2:1:1。
[0010]进一步地，将所述重组反应得到的产物依次进行转化实验和质粒提取，得到所述定量表达
Alyref
的载体
。
[0011]进一步地，所述转化实验包括：
S1、
将
Trans5
α
感受态细胞快速置于冰上静置5‑
10min
待其完全融化；
S2、
取5μ
L
重组反应得到的产物与完全融化的感受态细胞混合，用移液枪吹打3‑5次之后置于冰上
30min
，后将感受态细胞置于
42℃
水浴锅内热激
60
‑
90s
后快速置于冰上冰浴
3min
；
S3、
向步骤
S2
处理后的感受态细胞内加入
400
μ
L
无抗性
LB
培养基，置于摇床上在
37℃、220rpm
转速条件下活化
45min
，然后均匀涂布在含有
Amp
抗性的
LB
培养板上培养
12
‑
16h
；
S4、
用镊子夹
10
μ
L
的无菌枪头挑取单一菌落放入含有2‑
3mL Amp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种定量表达
Alyref
手段在制备诊断或延缓血液系统衰老试剂盒的应用
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建定量表达
Alyref
的载体实现定量表达
Alyref
手段，所述定量表达
Alyref
的载体的序列为
SEQ ID NO .1。3.
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量表达
Alyref
的载体的构建方法包括：把
k
‑
turn
序列
、L7Ae
以及小鼠
Alyref cDNA
插入到
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体内，其中1个所述定量表达
Alyref
的载体中包括2个
k
‑
turn
序列片段
、1
个
L7Ae
片段以及1个小鼠
Alyref cDNA
片段；其中，所述
k
‑
turn
序列为
SEQ ID NO .2
，所述
L7Ae
的序列为
SEQ ID NO .3
，所述小鼠
Alyref cDNA
的序列为
SEQ ID NO .4
，所述
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体的序列为
SEQ ID NO .5。4.
根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述定量表达
Alyref
的载体的构建方法包括：利用
SalI
内切酶和
BamHI
内切酶对所述
pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体进行双酶切，得到线性化载体；将
k
‑
turn
序列
、L7Ae
以及小鼠
Alyref cDNA
和所述线性化载体混合进行重组反应，得到所述定量表达
Alyref
的载体
。5.
根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述双酶切反应包括：将2μ
g pRRL
‑
PPT
‑
SF
‑
newMCS
‑
IRES2
‑
GFP
载体
、1
μ
L SalI
内切酶
、1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建伟，陈瑞轻，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：