检测制造技术

本发明专利技术提供一种基于数字

【技术实现步骤摘要】
检测NTRK基因融合的数字PCR引物探针组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及使用数字
PCR
，特别是微滴式数字
PCR(Droplet Digital PCR
；
ddPCR)
法检测
NTRK
基因融合突变的引物探针组合物
、
包含所述引物探针组合物的试剂盒，以及使用所述引物探针组合物或试剂盒检测
NTRK
基因融合突变的方法
。

技术介绍

[0002]NTRK(Neutrotrophic Tyrosine Receptor Kinase
；神经营养因子受体激酶
)
是一种神经营养因子受体复合激酶，家族成员包括
NTRK1、NTRK2
和
NTRK3
基因
。
原肌球蛋白受体激酶
(TRK)
家族包括三种蛋白质
TRKA、TRKB
和
TRKC
，在人类中它们分别由
NTRK1、NTRK2
和
NTRK3
基因编码
。
蛋白质
TRKA、TRKB
和
TRKC
通常在神经组织中表达
。
[0003]神经营养蛋白激酶
(NTRK)
基因
NTRK1、NTRK2
和
NTRK3
分别编码原肌凝蛋白受体酪氨酸激酶
TRKA、TRKB
和
TRKC
，在正常的健康组织中，
TRK
通路在中枢和外周神经系统的发育以及疼痛感觉方面发挥作用
。NTRK
基因重排导致
TRK
蛋白受体的组成性激活，并可能促进支持肿瘤发生的致癌信号通路，如
AKT
和
MEK
通路
。NTRK
基因融合在多种癌症类型中被发现，包括脑癌
、
头颈癌
、
甲状腺癌
、
软组织癌
、
肺癌和结肠癌
。
[0004]近年来已经确认
NTRK
基因的融合或突变与肿瘤形成密切相关
。
常见肿瘤的
NTRK
基因融合突变率很低，如肺癌
、
肠癌中突变率
0.2
％～3％，但在一些罕见肿瘤中，
NTRK
基因与其他基因的融合发生率非常高，包括婴儿纤维肉瘤
、
唾液腺癌和分泌性乳腺癌癌，发生率高达
90
％以上
。
这些融合的基因在机体中产生嵌合蛋白
。TRK
嵌合蛋白是持续活跃的，并永久地激活着
TRK
通路，进而驱动
TRK
融合肿瘤的扩散和生长
。
其中，在
NTRK
基因的3’
部分产生包含催化酪氨酸激酶域
、
与相关基因5’
部分的内框融合，驱动基因表达，促进蛋白二聚体化等变化，与
ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase,
间变性淋巴瘤激酶
)
和
ROS1(ROS proto
‑
oncogene 1,receptor tyrosine kinase,
受体酪氨酸激酶
)
基因融合的致癌原理类似
。
[0005]TRK
通路的失调会导致神经发育障碍和各种中枢神经系统
(CNS)
疾病，并且当
NTRK
基因与无关基因融合时也会诱发癌症发展
。NTRK
融合蛋白充当致癌驱动因子，促进癌细胞生长和存活
。
目前，发现在超过
25
类癌症中出现
NTRK
的融合
。
[0006]目前在研的有多款
TRK
抑制剂如拉罗替尼
(Larotrectinib)、
恩曲替尼
(Entrectinib)
等
。
这些药物的获批打破了之前药物必须以疾病作为适应症的界限，而开启了药物可以以基因突变为适应症的先河
。
[0007]恩曲替尼已获得美国
FDA
突破性治疗认定
(Breakthrough Therapy Designation)
的地位，用于治疗含有
NTRK
融合物的癌症
。
拉罗替尼是一种强效
、
高选择性的小分子抑制剂，可抑制所有三种
TRK
蛋白，目前已在成人和儿童人群中并行开发
。
该药物已在一项Ⅰ期研究中首次证明了在婴儿
、
儿童和青少年相关
NTRK
融合癌症中的安全性和高反应率
(>
肿瘤消退
>90
％
)
，从而建立了
NTRK
融合作为实体肿瘤或中枢神经系统肿瘤的一个易于处理的靶点
。
[0008]这两个药物的使用都必须以患者携带
NTRK
基因融合突变为前提，因此快速
、
准确地检测
NTRK
基因触合突变作为这些药物的伴随诊断，对这些药物的临床选择至关重要
。
[0009]目前用于
NTRK
基因融合检测的方法主要有免疫组织化学法
(IHC)、
荧光原位杂交技术
(FISH)、
逆转录聚合酶链式反应法
(RT
‑
PCR)
法和高通量测序法
(NGS)
等
。IHC
法是应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理检测肿瘤特异性抗原表达，是识别
NTRK
基因重排的一种有价值的工具，具有灵敏度高且筛选快速，但
IHC
法理论上只能检测表达的融合蛋白，判断上存在一定主观性，对于弱阳性结果需进一步用
FISH
等技术来验证
。
[0010]FISH
技术是一种常用的检测染色体重排的方法，利用靶
DNA
与荧光标记的核酸探针同源互补，形成靶
DNA
与核酸探针的杂交体，在荧光显微镜下对待测
DNA
进行定性
、
定量和相对定位分析，但该技术对于融合的两个基因在染色体位置上距离较近时，可能导致重排的分离信号不明显，产生假阴性结果，且成本较高，检测周期较长
。
[0011]NGS
法也可以用于检测基因融合，但成本高，操作相对比较复杂，对实验人员的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
引物探针组合物，其中所述引物探针组合物包含用于检测
NTRK
基因融合突变的以下至少一种引物探针组：检测
NTRK1
融合突变的引物探针组
A、D
；检测
NTRK2
融合突变的引物探针组
B、E
；检测
NTRK3
融合突变的引物探针组
C、F
；其中，引物探针组
A
检测涉及
NTRK1
第
10
外显子
(E10)
的融合；引物探针组
B
检测涉及
NTRK1
第
11
外显子
(E11)
的融合；引物探针组
C
检测涉及
NTRK2
第
13
外显子
(E13)
的融合；引物探针组
D
检测涉及
NTRK2
第
16
外显子
(E16)
的融合；引物探针组
E
检测涉及
NTRK3
第
14
外显子
(E14)
的融合；引物探针组
F
检测涉及
NTRK3
第
11
外显子
(E15)
的融合，其中每个引物探针组包含：分别特异性结合每种基因融合中的伙伴基因外显子的正向引物，分别特异性结合每种基因融合中的
NTRK
外显子的反向引物，分别特异性结合每种基因融合中的
NTRK
外显子的探针
。2.
根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中所述引物探针组
A
检测
NTRK1
与如下基因外显子的基因融合：
TPM3(E8)
；所述引物探针组
B
检测
NTRK2
与如下基因外显子的基因融合：
NACC2(E4)
；所述引物探针组
C
检测
NTRK3
与如下基因外显子的基因融合：
ETV6(E4)
；所述引物探针组
D
检测
NTRK1
与如下基因外显子的基因融合：
LMNA(E2)
；所述引物探针组
E
检测
NTRK2
与如下基因外显子的基因融合：
QKI(E6)
；所述引物探针组
F
检测
NTRK3
与下基因外显子的基因融合：
ETV6(E5)。3.
根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中所述引物探针组
A
检测的融合类型为
TPM3(E8)
‑
NTRK1(E10)
；所述引物探针组
B
检测的融合类型为
NACC2(E4)
‑
NTRK2(E13)
；所述引物探针组
C
检测的融合类型为
ETV6(E4)
‑
NTRK3(E14)
；所述引物探针组
D
检测的融合类型为
LMNA(E2)
‑
NTRK1(E11)
；所述引物探针组
E
检测的融合类型为
QKI(E6)
‑
NTRK2(E16)
；所述引物探针组
F
检测的融合类型为
ETV6(E5)
‑
NTRK3(E15)。4.
根据权利要求1所述的引物探针组合物，其中所述引物探针组
A
包含具有
SEQ ID No:1
～2所示的序列的引物和具有
SEQ ID No:3
所示的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：周焕焕，任文静，王洋，
申请(专利权)人：杭州瑞普医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：