检测NTRK基因融合的引物探针组合物、试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测受试者样品中NTRK基因家族基因融合的引物探针组合物、引物探针组、试剂盒及方法，及所述引物探针组合物在检测所述基因融合中的应用。在检测所述基因融合中的应用。

【技术实现步骤摘要】
检测NTRK基因融合的引物探针组合物、试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及用于荧光定量法的检测NTRK基因融合的引物探针组、引物探针组合物、试剂盒及使用方法。还涉及所述引物探针组合物在检测NTRK基因融合的存在和/或类型中的应用。

技术介绍

[0002]NTRK(Neutrotrophic Tyrosine Receptor Kinase；神经营养因子酪氨酸受体激酶)基因是编码神经营养因子酪氨酸受体激酶的基因家族，家族成员包括NTRK1、NTRK2和NTRK3基因。原肌球蛋白受体激酶(TRK)家族包括三种蛋白质TRKA、TRKB和TRKC，在人类中它们分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。蛋白质TRKA、TRKB和TRKC通常在神经组织中表达。
[0003]在正常的健康组织中，TRK通路在中枢和外周神经系统的发育以及疼痛感觉方面发挥作用。NTRK基因重排导致TRK蛋白受体的组成性激活，并可能促进支持肿瘤发生的致癌信号通路，如AKT和MEK通路。NTRK基因融合在多种癌症类型中被发现，包括脑癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织癌、肺癌和结肠癌。
[0004]近年来已经确认NTRK基因的融合或突变与肿瘤形成密切相关。常见肿瘤的NTRK融合突变率很低，如肺癌、肠癌中突变率0.2％～3％。但在一些罕见肿瘤中，NTRK基因与其他基因的融合发生率非常高，包括婴儿纤维肉瘤、唾液腺癌和分泌性乳腺癌，发生率高达90％以上。这些融合的基因在机体中产生嵌合蛋白。TRK嵌合蛋白是持续活跃的蛋白，并永久地激活着TRK通路，进而驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。
[0005]TRK通路的失调会导致神经发育障碍和各种中枢神经系统(CNS)疾病，并且当NTRK基因与无关基因融合时也会诱发癌症发展。NTRK融合蛋白充当致癌驱动因子，促进癌细胞生长和存活。
[0006]目前，发现在超过25类癌症中出现NTRK的融合，并且针对NTRK的融合的靶点药物拉罗替尼(Larotrectinib)、恩曲替尼(Entrectinib)已通过FDA认证，且效率显著。由于效果显著，NTRK被称为钻石基因，NTRK的融合和突变成为癌症治疗的新靶点。
[0007]2018年11月，拉罗替尼成为第一个获得FDA批准的“广谱靶向药物”，用于NTRK融合突变的全部实体瘤，包括成年和儿童肿瘤患者。拉罗替尼在不同类型的实体瘤中表现出75％的总缓解率。2019年3月，另一个同类广谱靶向药恩曲替尼(RXDX
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101)也获批。在NTRK融合阳性实体瘤患者中，恩曲替尼的客观缓解率ORR为57.4％。目前也有多个靶向NTRK基因融合的新药在进行临床实验。这些药物在多重肿瘤中显示较为明显的临床获益，因此，快速准确地检测NTRK基因家族融合，对以NTRK基因家族基因融合为靶向的药物的研发和肿瘤患者评估自身用药选择来说显得尤为重要。
[0008]为了检测NTRK基因融合和耐药突变，目前常用的技术主要包括：免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、逆转录聚合酶链反应(RT
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PCR)和二代测序基因检测(NGS)等。
[0009]IHC法应用免疫学抗原与抗体的特异性结合来检测肿瘤特异性抗原表达，具有快速筛选的特点，可以做到24h左右出结果。但IHC法针对的是蛋白的表达量，判断上存在一定
主观性，因此当出现弱阳性结果，需进一步用FISH等技术来验证。
[0010]FISH技术利用了靶DNA与荧光标记的核酸探针的同源互补性，通过形成靶DNA与核酸探针的杂交体，可以在荧光显微镜下对待测DNA进行定性、定量和相对定位分析。但一组分离探针通常只用于一种融合突变，较为单一，而且当融合的两个基因在染色体位置上的距离较近时，该技术可能导致重排的分离信号不明显，从而产生假阴性结果。且FISH技术成本较高，检测周期较长。
[0011]另外，使用RT
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PCR、IHC或FISH检测NTRK融合难以明确与NTRK融合的伴侣基因，而且存在漏检或错误检测的概率。
[0012]高通量测序法也可以用于检测基因融合，但操作相对比较复杂，对实验人员的技术要求较高，耗时长，通常要3
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5天才可出检测结果。
[0013]荧光定量检测也是一种检测NTRK基因融合的方法。然而，现有的针对NTRK基因融合的NTRK荧光定量检测试剂盒能够检测的位点较少，不适应检测多种融合类型的需求。为了检测多种融合类型，则需要多盒联用，这会大幅提高成本。
[0014]因此，本领域需要一种检测时间短，能够覆盖多种融合类型的NTRK基因融合检测方法。

技术实现思路

[0015]专利技术人设计了通过多重荧光PCR来检测NTRK融合的8组引物与探针的组合(下文中称为“引物探针组”)。包含所述8组引物探针组的引物探针组合物或试剂盒可用于从样品提取的RNA模板，并且能够一次检测77种NTRK融合类型。
[0016]本专利技术的引物探针组能够覆盖多种融合类型的NTRK基因融合，在检测目标融合类型时生成的扩增曲线良好，可检测下限为500个拷贝(copies)，最短检测时间可达120分钟。
[0017]由此，本专利技术第一方面提供一种检测NTRK基因融合的引物探针组合物，其包含下述一种或多种引物探针组：
[0018]用于检测NTRK1融合类型的引物探针组A、B、C、D；
[0019]用于检测NTRK2融合类型的引物探针组E、F；
[0020]用于检测NTRK3融合类型的引物探针组G、H；
[0021]其中，
[0022]所述引物探针组A检测涉及NTRK1第8外显子(NTRK1(Ex8))或第11外显子(NTRK1(Ex11))的基因融合；
[0023]所述引物探针组B检测涉及NTRK1第8外显子(NTRK1(Ex9))、第10外显子(NTRK1(Ex10))或第13外显子(NTRK1(Ex13))的基因融合；
[0024]所述引物探针组C检测涉及NTRK1第12外显子(NTRK1(Ex12))的基因融合；
[0025]所述引物探针组D检测涉及NTRK1第14外显子(NTRK1(Ex14))或第16外显子(NTRK1(Ex16))的基因融合；
[0026]所述引物探针组E检测涉及NTRK2第12外显子(NTRK2(Ex12))或第13外显子(NTRK2(Ex13))的基因融合；
[0027]所述引物探针组F检测涉及NTRK2第15外显子(NTRK1(Ex15))、第16外显子(NTRK2(Ex16))或第17外显子(NTRK2(Ex17))的基因融合；
[0028]所述引物探针组G检测涉及NTRK3第14外显子(NTRK3(Ex14))的基因融合；
[0029]所述引物探针组H检测涉及NTRK3第12外显子(NTRK3(Ex12))、NTRK3第13外显子(NTRK3(Ex13))、NTRK3第1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测NTRK基因融合的引物探针组合物，所述引物探针组合物包含以下至少一组引物探针组：用于检测NTRK1融合类型的引物探针组A、B、C、D；用于检测NTRK2融合类型的引物探针组E、F；用于检测NTRK3融合类型的引物探针组G、H，其中，所述引物探针组A检测涉及NTRK1第8外显子(NTRK1(Ex8))或第11外显子(NTRK1(Ex11))的基因融合；所述引物探针组B检测涉及NTRK1第8外显子(NTRK1(Ex9))、第10外显子(NTRK1(Ex10))或第13外显子(NTRK1(Ex13))的基因融合；所述引物探针组C检测涉及NTRK1第12外显子(NTRK1(Ex12))的基因融合；所述引物探针组D检测涉及NTRK1第14外显子(NTRK1(Ex14))或第16外显子(NTRK1(Ex16))的基因融合；所述引物探针组E检测涉及NTRK2第12外显子(NTRK2(Ex12))或第13外显子(NTRK2(Ex13))的基因融合；所述引物探针组F检测涉及NTRK2第15外显子(NTRK1(Ex15))、第16外显子(NTRK2(Ex16))或第17外显子(NTRK2(Ex17))的基因融合；所述引物探针组G检测涉及NTRK3第14外显子(NTRK3(Ex14))的基因融合；所述引物探针组H检测涉及NTRK3第12外显子(NTRK3(Ex12))、NTRK3第13外显子(NTRK3(Ex13))、NTRK3第15外显子(NTRK3(Ex15))或NTRK3第16外显子(NTRK3(Ex16))的基因融合，其中每个引物探针组包含：分别特异性结合每种基因融合中的伙伴基因外显子的正向引物，分别特异性结合每种基因融合中的NTRK外显子的反向引物，以及分别特异性结合每种基因融合中的NTRK外显子的探针。2.权利要求1所述的引物探针组合物，其中各个引物探针组检测的基因融合类型如下所示：所述引物探针组A检测NTRK1与如下基因外显子的基因融合：IRF2BP2(Ex1)、LMNA(Ex2)、LMNA(Ex3)、LMNA(Ex5)、LMNA(Ex10)、LMNA(Ex11del)、PPL(Ex21)、GRIPAP1(Ex22)、BCAN(Ex13)；所述引物探针组B检测NTRK1与如下基因的基因融合：TFG(Ex5)、TPR(Ex21)、TFG(Ex4)、TPM3(Ex10)、TPM3(Ex8)、SQSTM1(Ex5)、TPR(Ex10)、TPR(Ex16del)、TPR(Ex21)、CD74(Ex8)、IRF2BP2(Ex1)、IRF2BP2(Ex1del48)、PPL(Ex21)、GRIPAP1(Ex22)、CHTOP(Ex5)、ARHGEF2(Ex21)、NFASC(Ex21)、TFG(Ex5)、TFG(Ex6)、TPM3
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(Ex7del)、BCAN(Ex12)、PPL(Ex11)；所述引物探针组C检测NTRK1与如下基因的基因融合：TPM3(Ex8)、TRP(Ex6)、SSBP2(Ex12)、MPRIP(Ex18)、MPRIP(Ex14)、MPRIP(Ex21)、LMNA(Ex10)、LMNA(Ex8)、LMNA(Ex4)、LMNA(Ex2)、LMNA(Ex6del)、LMNA(Ex12)、GRIPAP1(Ex22)；所述引物探针组D检测NTRK1与如下基因的基因融合：MPRIP(Ex21)、LMNA(Ex2)；所述引物探针组E检测NTRK2与如下基因的基因融合：VCL(Ex16)、AFAP1(Ex13)、NCAA2(Ex4)；所述引物探针组F检测NTRK2与如下基因的基因融合：TRIM24(Ex12)、TRAF2(Ex9)、ETV6
(Ex5)、TRIM24(Ex12)、AGBL4(Ex6)、SQSTM1(Ex5)、QKI(Ex6)、STRN(Ex3)、PAN3(Ex1)、SQSTM1(Ex5)、BCR(Ex1)；所述引物探针组G检测NTRK3与如下基因的基因融合：AKAP13(Ex3)、BTBD1(Ex4)、EML4(Ex2)、ETV6(Ex4)、ETV6(Ex5)、RBPMS(Ex5)、SQSTM1(Ex5)、STRN(Ex3)、TFG(Ex6)；所述引物探针组H检测NTRK3与如下基因的基因融合：ETV6(Ex4)、ETV6(Ex4)、ETV6(Ex5)、ETV6(Ex5)、ETV6(Ex4)、ETV6(Ex5)、ETV6(Ex6)、SQSTM1(Ex6)。3.权利要求1或2所述的引物探针组合物，其中所述引物探针组A检测如下9种融合类型：NTRK1(Ex8)
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IRF2BP2(Ex1)；NTRK1(Ex10)
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LMNA(Ex2)；NTRK1(Ex10)
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LMNA(Ex3)；NTRK1(Ex10)
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LMNA(Ex5)；NTRK1(Ex10)
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LMNA(Ex10)；NTRK1(Ex10)
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LMNA(Ex11del)；NTRK1(Ex10)
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PPL(Ex21)；NTRK1(Ex10)
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GRIPAP1(Ex22)；NTRK1(Ex10)
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BCAN(Ex13)；所述引物探针组B检测如下22种融合类型：NTRK1(Ex9)
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TFG(Ex5)；NTRK1(Ex9)
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TPR(Ex21)；NTRK1(Ex9)
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TFG(Ex4)；NTRK1(Ex9)
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TPM3(Ex10)；NTRK1(Ex10)
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TPM3(Ex8)；NTRK1(Ex10)
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SQSTM1(Ex5)；NTRK1(Ex10)
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TPR(Ex10)；NTRK1(Ex10)
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TPR(Ex16del)；NTRK1(Ex10)
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TPR(Ex21)；NTRK1(Ex10)
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CD74(Ex8)；NTRK1(Ex10)
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IRF2BP2(Ex1)；NTRK1(Ex10)
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IRF2BP2(Ex1del48)；NTRK1(Ex10)
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PPL(Ex21)；NTRK1(Ex10)
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GRIPAP1(Ex22)；NTRK1(Ex10)
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CHTOP(Ex5)；NTRK1(Ex10)
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ARHGEF2(Ex21)；NTRK1(Ex10)
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NFASC(Ex21)；NTRK1(Ex10)
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TFG(Ex5)；NTRK1(Ex10)
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TFG(Ex6)；NTRK1(Ex10)
‑
TPM3
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(Ex7del)；NTRK1(Ex10)
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BCAN(Ex12)；NTRK1(Ex13)
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PPL(Ex11)；所述引物探针组C检测如下13种融合类型：NTRK1(Ex12)
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TPM3(Ex8)；NTRK1(Ex12)
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TRP(Ex6)；NTRK1(Ex12)
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SSBP2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，任文静，赵钟毓，
申请(专利权)人：杭州瑞普医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：